Photobiochemische Mechanismen von Biomolekülen, die für die keimtötende UV-Bestrahlung bei 222 und 254 nm relevant sind

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 18217 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Um Viren und Mikroorganismen zu inaktivieren, ist ultraviolettes Licht im kurzwelligen Bereich ein vielversprechender Kandidat zur Eindämmung von Krankheitsinfektionen. Keimtötende Quecksilberlampen, die bei 254 nm emittieren, und KrCl-Excimerlampen, die bei 222 nm emittieren, verfügen über Sterilisationseigenschaften. In dieser Arbeit wurde die Wellenlängenabhängigkeit der photobiochemischen Mechanismen mit 222- und 254-nm-Bestrahlung untersucht, um die zugrunde liegenden Schädigungsmechanismen von DNA/RNA und Proteinen zu analysieren, wobei Escherichia coli, eine Protease, ein Oligopeptid, Aminosäuren, Plasmid-DNA und Nukleoside verwendet wurden . Die Photoreparatur beschädigter DNA und die „dunkle“ Umkehrung der Hydrate von Uracil-Phosphoramidit-Kopplungsblöcken wurden ebenfalls untersucht.

Die Bestrahlung mit ultraviolettem (UV) Licht ist eine effiziente Methode zur Inaktivierung von Viren und Mikroorganismen mit minimalen unerwünschten Auswirkungen auf die Gesundheit von Säugetieren oder auf die Haut und Augen1,2,3,4,5. Frühere Studien haben die Wellenlängenreaktion von Krankheitserregern untersucht, um sicherzustellen, dass UV-Desinfektionssysteme die menschliche Gesundheit beispielsweise vor SARS-CoV-26,7,8 angemessen schützen. Ein Ansatz zur Verhinderung der Übertragung von Viren besteht darin, über die Luft übertragene Krankheitserreger in öffentlichen Räumen und Transporträumen, Firmenbüros und Krankenhäusern zu inaktivieren, wenn sich dort Menschen aufhalten. Dieser Ansatz ohne Schädigung der exponierten Säugetierhaut kann durch eine kurze optische Eindringtiefe des UV-Lichts erreicht werden. Eine niedrige Dosis bei 222 nm war bei der Inaktivierung aerosolisierter Coronaviren wirksam6. Es wurde eine Bestrahlung bei 222 nm auf geschichteten Zellschichten durchgeführt, was zu dem Schluss führte, dass UV-Bestrahlung für die Lebensfähigkeit der Zellen biologisch unbedenklich ist9,10. Ein ungefiltertes 222-nm-Breitbandlicht wurde zur Bekämpfung lebensmittelbedingter Krankheitserreger eingesetzt11. Laut der Literatur „einer Sammlung und Analyse hundertjähriger Daten zu Ergebnissen über die Auswirkungen von UV-Bestrahlung auf Mikroorganismen, menschliche und tierische Zellen, Haut und Augen“ sind die durchschnittlich erforderlichen Log-Reduktionsdosen bei 222 nm etwas höher Im Vergleich zur Bestrahlung bei 254 nm sollte eine angemessene Dosis die meisten Krankheitserreger in den meisten Medien um mehrere Größenordnungen reduzieren, ohne die menschliche Haut oder Augen zu schädigen12.

UV-Strahlung führt zu Schäden an Proteinen und Nukleinsäuren. Die Bestrahlung bei 254 nm inaktivierte SARS-CoV-2 durch die Induktion einer viralen Genomschädigung und schädigte virale Proteine ​​nicht12. Matrix- und Nukleokapsidproteine ​​von Viren und Mikroorganismen absorbieren UV-Licht und verringern die Lichtdichte, die Nukleinsäuren erreicht. Daher besteht der keimtötende Mechanismus bei kurzen UV-Wellenlängen hauptsächlich im Proteinabbau, während bei langen UV-Wellenlängen Nukleinsäuren beschädigt werden1,2,13,14,15,16. Ribonukleinsäure (RNA) und Desoxyribonukleinsäure (DNA) bestehen aus einem Zucker-Phosphat-Grundgerüstprotein und Pyrimidin-/Purinbasen. Die UV-Aktionsspektren für die Induktion von Cyclobutan-Pyrimidin-Dimeren (CPDs) und Pyrimidin-(6-4)Pyrimidon-Photoprodukten ((6-4)PPs) in DNA erreichen ihren Höhepunkt bei 260 nm und stimmen mit dem Absorptionsspektrum von in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gelöster DNA überein, was darauf hindeutet Die direkte Photoabsorption durch Thymin induziert DNA-Läsionen17. Es wurden mechanistische Einblicke in die photochemische Bildung eines Hydrat-Addukts der RNA-Nukleobase in einer wässrigen Umgebung berichtet18.

In diesem Artikel berichten wir über die photochemischen Mechanismen der UV-Bestrahlung bei 222 und 254 nm auf Biomoleküle, die für Viren und Mikroorganismen relevant sind; (a) Abbau von aromatischen Aminosäuren, einem Oligopeptid, einer Protease und Proteinen, (b) Abbau von Plasmid-DNA und ihrem Photoreparaturprozess nach der Transformation in Escherichia coli (E. coli)-Zellen, (c) Abbau eines Cofaktors in den Enzymatischer CPD-Photoreparaturprozess, (d) Abbau von Nukleosiden, (e) Produktausbeuten aus RNA-UpU und DNA-dTpdT und (f) Selbstreversion des photohydratisierten UpU unter dunklen Bedingungen.

Für Überlebensmessungen von E. coli-Bakteriophagen-MS2-Zellen wurde nach UV-Bestrahlung eine Plaquezählung der 24 Stunden lang auf Luria-Bertani (LB)-Agarplatten kultivierten Zellen durchgeführt, wie in Abb. 1a gezeigt. Die 222-nm-Bestrahlung führte zu einem 1,5-mal schnelleren Zerfall als die 254-nm-Bestrahlung. Abbildung 1b zeigt die Photoreparaturkurven von E. coli K-12-Zellen bei 365 nm (0,5 mJ/cm2) nach UV-Bestrahlung mit einer Dosis von 9 mJ/cm2 bei 222 und 254 nm. Die bei 222 nm bestrahlten Zellen erholten sich nicht, jene bei 254 nm hingegen schon. Der „dunkle“ Reparaturprozess nach der Photolyse nach UV-Bestrahlung von E. coli K-12 bei 222 und 254 nm wurde während der 6-stündigen Inkubation nicht beobachtet.

(a) Überlebensraten des E. coli-Bakterophagen MS2 unter UV-Bestrahlung. Logarithmische Skalenbasis 10. (Schwarzer Kreis) 222 nm, (Schwarze Raute) 254 nm. Das Suszeptibilitätsverhältnis k(222 nm)/k(254 nm) beträgt 1,5 für die Zerfälle. N = 2 und n = 3, (b) (linke Hälfte) Überlebensraten von E. coli K-12, bestrahlt bei 222 und 254 nm, (rechte Hälfte) Photoreparaturraten durch Bestrahlung bei 365 nm. (Schwarzer Kreis) 222-nm-Bestrahlung, gefolgt von 365-nm-Bestrahlung, (weißer Kreis) 222-nm-Bestrahlung, gefolgt von Konservierung unter dunklen Bedingungen (Kontrollexperiment), (schwarze Raute) 254-nm-Bestrahlung, gefolgt von 365-nm-Bestrahlung, ( weißer Diamant) 254-nm-Bestrahlung, gefolgt von Konservierung unter dunklen Bedingungen (Kontrollexperiment). N = 2 und n = 3.

Die Bilddensitometrie in Abb. 2a zeigt eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit zugesetztem DTT und ohne Erhitzen, um Signaturen für Proteine ​​von E. coli K-12 (6,9 log KBE/ml) zu erkennen. Eine Dosis von 50 mJ/cm2 bei 222 nm verringerte die Densitometrieintensität der Signaturen mit höherer Molmasse, während bei einer Dosis von bis zu 500 mJ/cm2 bei 254 nm keine signifikante Verringerung beobachtet wurde. Die ähnliche Wellenlängenabhängigkeit von Rinderserumalbumin wurde beobachtet, wie in der ergänzenden Abbildung S1 gezeigt.

(a) SDS-PAGE der E. coli K12-Proteinsignatur nach Exposition gegenüber steigenden UV-Lichtdosen bis zu 500 mJ/cm2, wie in jeder Spur für 222- und 254-nm-Bestrahlung gezeigt. (b) Fluoreszenzfärbung von E. coli K12 nach UV-Bestrahlung. (oben) 222 nm und (unten) 254 nm mit einer Dosis von 200 mJ/cm2.

Die Schädigung der Zellmembran von E. coli K-12 wurde mithilfe der Fluoreszenzfärbungsmethode in Abb. 2b mit einer Dosis von 200 mJ/cm2 bestätigt. Die rote Fluoreszenz von Propidiumiodid war in der bei 222 nm bestrahlten Probe vorherrschend, was darauf hindeutet, dass die Zellen tot waren und die Zellmembranen beeinträchtigt waren. Die bei 254 nm bestrahlte Probe emittierte grüne Fluoreszenz des SYTO9-Farbstoffs in den Zellmembranen, was darauf hindeutet, dass die Zellen über intakte Zellmembranen verfügten.

Die Absorptionsspektren wässriger Lösungen der üblichen aromatischen Aminosäuren Tryptophan (Trp), Tyrosin (Tyr), Phenylalanin (Phe) und Histidin (His) sind in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt. Seine Absorption erfolgt bei 222 nm, jedoch nicht bei 254 nm. Trp und Tyr weisen sowohl bei 222 als auch bei 254 nm eine starke Absorption auf, wohingegen Phe eine schwache Absorption aufweist. Eine Protease, Chymotripsin, katalysiert die Peptidbindungshydrolyse von Bz-Tyr-pNA (BTPNA in 50 % DMSO / 50 % Wasser) in seiner S1-Bindungstasche von His 57, Ser 195 und Asp 102. Zur Beurteilung der UV-Hemmung der katalytischen Aktivität , aq. HCl-Lösungen von α-Chymotripsin wurden bei 222 und 254 nm (0,5 mW/cm2) mit Dosen von 100 und 500 mJ/cm2 bestrahlt. Nach UV-Bestrahlung von α-Chymotripsin wurde eine Mischung aus der α-Chymotripsin-Lösung (75 μg/ml) und einer BTNPA-Lösung bei einer Sondenwellenlänge von 405 nm in einer Tris∙HCl-Pufferlösung überwacht, um das Hydratationsprodukt p- zu untersuchen. Nitroanilin, wie in Abb. 3 dargestellt. Die höhere Dosis und die kürzere UV-Wellenlänge führten zu einer geringeren Produktion von p-Nitroanilin. Die Verhältnisse der Steigungen, r = (UV-bestrahlt)/(Kontrolle), entsprechen den restlichen katalytischen Aktivitäten. Für eine UV-Dosis von 100 mJ/cm2, die aus den Daten zwischen t = 10–20 min in Abb. 3 erhalten wird, beträgt r(222 nm) 0,30, während r(254 nm) 0,81 beträgt, was darauf hindeutet, dass die Aktivität 3,5 betrug (= 70/19) Mal reduziert durch 222-nm-Bestrahlung als durch 254-nm-Bestrahlung. Die Auswirkungen der UV-Dosis auf die Absorptionsspektren der α-Chymotripsin-Lösungen wurden für Dosen von 0–500 mJ/c2 gemessen, wie in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt. Die Absorptionsspektren weisen aufgrund aromatischer Aminosäurereste (Trp, Tyr und Phe) einen Peak bei etwa 280 nm auf. Diese Chromophore absorbieren 254-nm-Photonen, um die Struktur zu stören und die katalytische Fähigkeit zu verringern, ohne dass sich das Absorptionsspektrum nennenswert ändert. Die spektrale Änderung nach der 222-nm-Bestrahlung wurde bei 225 nm (Abnahme der Absorption) und 250 nm (Anstieg) nachgewiesen. Die Abnahme der katalytischen Fähigkeit und der spektralen Absorptionsintensität impliziert den Photoabbau der His-Seitenkette in der Bindungstasche, da (a) His nicht nur die sich entwickelnden Ladungen stabilisiert, sondern auch einen Weg für den Protonentransfer bereitstellt, ohne den katalytische Reaktionen Schwierigkeiten hätten fortschreitet, und (b) His ist ein starkes Chromophor bei 222 nm.

Produktion von p-Nitroanilin durch Überwachung der Absorptionsintensität bei 405 nm nach UV-Bestrahlung von wässrigen Lösungen von Chymotrypsin. Die UV-Dosen in mJ/cm2 betragen (blaue Raute) 100 und (blauer Kreis) 500 bei 222 nm, (grüne Raute) 100 und (grüner Kreis) 500 bei 254 nm, (schwarzer Kreis) 0. Der anfängliche Buckel wird durch Licht verursacht Streuung. n = 1.

Bezüglich der geringen Verringerung der katalytischen Aktivität r nach 254-nm-Bestrahlung ist His aufgrund seiner schwachen Photoabsorption relevant. Obwohl die katalytische Reaktion gehemmt wurde, zeigt die ergänzende Abbildung S3 nur eine geringfügige Änderung der UV-Absorptionsspektren nach 254-nm-Bestrahlung. Dies liegt daran, dass die Photoprodukte möglicherweise ein UV-Spektrum aufweisen, das dem ursprünglichen α-Chymotripsin-Spektrum ähnelt. McLaren und Luse19 berichteten, dass bei ihrer 254-nm-Bestrahlung von Chymotrypsin durch chemische Analyse etwa ein Trp-Rest pro Chymotrypsin-Molekül zerstört wurde und keine Disulfidbindungen gebrochen wurden. Es wurden keine Phe-, Tyr- oder His-Reste verändert.

Um die Rolle der Reste weiter zu untersuchen, wurde ein Oligopeptid, Angiotensin II (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe), in wässriger Lösung (50 μM) bei 222 und 254 nm UV-bestrahlt. Die HPLC-Analyse für eine Dosis von 100 mJ/cm2 ist in Abb. 4a dargestellt. Bei der 222-nm-Bestrahlung wurden die Seitenpeaks der photoproduzierten Peptide bei zwei Monitorwellenlängen von 215 und 280 nm beobachtet, während bei der 254-nm-Bestrahlung kein Seitenpeak beobachtet wurde. Die roten Pfeile zeigen das Photoprodukt an, das einem Tyr enthaltenden Peptid zugeordnet wurde, da sie bei der Überwachung sowohl bei 215 als auch bei 280 nm auftraten. Das blaue ist ein Peptid, das die Produkte des Photoabbaus von His enthält, da es bei 280 nm stark erscheint. Abbildung 4b zeigt, dass die Bestrahlung bei 222 nm eine starke Reduktion hervorrief, während sie bei 254 nm sehr schwach war. Dosisabhängige Variationen der HPLC-Peakintensitäten sind in der ergänzenden Abbildung S4 dargestellt. Bei einer Dosis von 0–1,0 J/cm2 nahm die Produktintensität zu und die Angiotensin-II-Intensität ab. Abbildung 4b zeigt auch den Entlüftungseffekt von wässrigen Lösungen mit sprudelndem N2-Gas unter Ultraschall. Die Entlüftung veränderte die Reduktionsrate nur geringfügig.

(a) HPLC-Aufklärungsprofile nach UV-Bestrahlung von Angiotensin II mit einer Dosis von 100 mJ/cm2 bei 222 und 254 nm. Die Überwachungswellenlängen betragen (oben) 215 nm und (unten) 280 nm. Die roten Pfeile zeigen das Photoprodukt an, das einem Tyrosin enthaltenden Peptid zugeordnet ist, und der blaue Pfeil zeigt ein Peptid an, das das Produkt aus dem Photoabbau von Histidin enthält. (b) Reduktion von Angiotensin II durch UV-Bestrahlung. (Blauer Kreis) 222 nm und (grüne Raute) 254 nm mit aq. Lösungen belüftet, (gelber Kreis) 222 nm mit aq. Lösungen entlüftet. n = 3.

Abbildung 4b zeigt die Wellenlängenabhängigkeit der Reduktion von Angiotensin II mit starker Reduktion durch Bestrahlung bei 222 nm und nahezu keiner Reduktion bei 254 nm. Um die Rolle der Aminosäurereste beim Photoabbau zu beurteilen, wurden freies Tyr, Trp, Phe und His, aq. Lösungen (50 μM) wurden bei 222 und 254 nm mit Dosen von 0–2 J/cm2 in der ergänzenden Abbildung S5 bestrahlt. Die verbleibenden Prozentsätze bei einer Dosis von 1,0 J/cm2 waren wie folgt: bei 222 nm His (< 1 %): Trp (16 %): Tyr (38 %): Phe (82 %) und bei 254 nm His (100). %):Trp (71 %): Tyr (88 %): Phe (95 %). Tyr wird bei 254 nm deutlich reduziert und ca. achtmal weniger reduziert als His bei 222 nm. Somit stimmt die Photoreduktionsanfälligkeit für His mit der Wellenlängenabhängigkeit der beobachteten Reduktionsraten von Angiotensin II in Abb. 4b überein, nicht jedoch für Tyr, da freies Tyr eine nennenswerte Absorption bei 245 nm aufweist und His keine Absorption aufweist. Der Entlüftungseffekt der Angiotensin-II-Lösung ist in Abb. 4b gering. Es ist bekannt, dass His und Trp beim Oxidationsprozess freier aromatischer Aminosäuren mit nennenswerter Geschwindigkeit mit Singulettsauerstoff reagieren20. Wie in der ergänzenden Abbildung S5 gezeigt, verringerte die Entlüftung die UV-Reduktionsrate für Trp während der 222-nm-Bestrahlung um das Zweifache, nicht jedoch für His. Daher ist His-Rest der plausibelste für die UV-Reduktion von Angiotensin II. Die Entgasung von aq. Die Lösung bot keinen Schutz gegen den His-Abbau bei 222 nm, was bedeutet, dass die primäre Photochemie bei 222 nm ein direkter Photoabbau ist und unabhängig von gelöstem O2 ist.

Nach UV-Anregung auf DNA können benachbarte Pyrimidine Läsionen, CPD oder (6-4)PP bilden. Die CPD-Läsion wird durch eine Photolyase und ein Coenzym (Flavinadenindinukleotid, FAD) durch langwelliges Licht photorepariert, während dies bei der (6-4)PP-Läsion nicht der Fall ist. Wir untersuchten UV-Schäden von Plasmid-DNA (1, 5, 10 pg) in Tris∙EDTA-Pufferlösungen bei 222 und 254 nm, die nach UV-Bestrahlung in kompetente E. coli HB101-Zellen transformiert wurden. Abbildung 5 zeigt die Transformationseffizienzkurven, für die die Rohdaten der Koloniezählung in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt sind. Die Dosen bei 21 und 40 % Transformation betrugen 68 und 34 mJ/cm2 für 222 nm, während für 254 nm die Dosen bei 17 und 42 % Transformation 36 und 18 mJ/cm2 betrugen. Die Anfälligkeit für Lichtschäden von Plasmid-DNA ist bei 222 nm doppelt so gering als bei 254 nm aufgrund der schwächeren Absorption der DNA bei 222 nm14.

Transformationseffizienz von E. coli HB101 als Funktion der UV-Dosis auf Plasmid-DNA. (Blauer Kreis) 222 nm und (grüne Raute) 254 nm. n = 1.

Um die Photoreparaturfähigkeit der beschädigten DNA zu beurteilen, wurden zwei Sätze von Plasmid-DNA-Proben, die durch UV-Bestrahlung auf 20 % Restgehalt reduziert wurden, in Ampicillin-LB-Platten in E. coli transformiert. Nach 60 Minuten mit und ohne Photoreparaturbestrahlung bei 365 nm (0,36 mW/cm2) wurden die Platten zur Kultivierung platziert und anschließend wurde die Kolonienzählung durchgeführt. Die durchschnittlichen Koloniezahlen für die 222-nm-Bestrahlung waren N222 (mit 365 nm) = 61 und N222 (ohne 365 nm) = 40. Für die 254-nm-Bestrahlung waren N254 (mit 365 nm) = 61 und N254 (ohne 365 nm). ) = 31. Das Photoreparatur-Inkrementverhältnis bei 222 nm beträgt R222 = N222 (mit 365 nm)/N222 (ohne 365 nm) – 1 = 61/40–1 = 0,53, während bei 254 nm R254 = 61/31–1 beträgt = 0,97. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass (a) die Produktion von CPD in Plasmid-DNA, die bei 222 nm bestrahlt wurde, geringer ist als bei 254 nm und/oder (b) die CPD-Photoreparatur durch die Photolyase bei 222 nm weniger aktiv ist als bei 254 nm.

Die Photolyase enthält ein FAD-Coenzym, um CPD in die benachbarten Pyrimidine umzuwandeln. Wie in Abb. 6 gezeigt, wird UV-Bestrahlung von FAD (25 μg/ml) in wässriger Lösung durchgeführt. Lösung bei 222 nm bis zu einer Dosis von 18 J/cm2 induzierte Schäden, die dreifach effizienter waren als bei 254 nm, was bedeutet, dass CPD-Photoreparaturen durch die Photolyase durch Bestrahlung bei 222 nm weniger aktiv wurden als bei 254 nm. HPLC-Aufklärungsprofile sind in der ergänzenden Abbildung S6 dargestellt.

Reduzierung der FAD als Funktion der Dosis. UV-Bestrahlung bei (blauer Kreis) 222 nm und (grüne Raute) 254 nm. n = 1.

DNA besteht aus einem Zucker-Phosphat-Rückgrat, an das die vier Nukleobasen Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T) durch glykosidische Bindungen gebunden sind, während T durch Uracil (U) ersetzt ist RNA. Die Absorptionsspektren von Nukleosiden haben einen Peak im Bereich von 250–270 nm, und das Rückgrat absorbiert bei etwa 210 nm. Die Lichtschädigung dieser Nukleoside in wässriger Lösung. Lösung (50 μM) wurde durch Messung der Absorptionsspektraländerungen untersucht. Wie in Abb. 7 gezeigt, wurden die Pyrimidinbasen C und U bei Dosen von bis zu 5,0 J/cm2 durch 222-nm- und 254-nm-Bestrahlung vergleichbar lichtgeschädigt. Die Pyrimidinbase T wurde bei 222 nm lichtgeschädigt, bei 254 nm jedoch nicht. Somit ist T am plausibelsten für die UV-Schädigung von Plasmid-DNA bei 222 nm in Abb. 5. Ebenso wurden bei UV-Bestrahlung keine nennenswerten Veränderungen im Absorptionsspektrum der Purinnukleobasen Adenosin und Guanosin beobachtet, wie in der ergänzenden Abb. gezeigt . S7. Da sich der Mechanismus der Lichtschädigung aufgrund der unterschiedlichen Umgebungsbedingungen zwischen Nukleosidmonomer und Plasmid stark unterscheidet, sind zusätzliche Experimente erforderlich, um diese Annahmen zu bestätigen.

Veränderungen in den Absorptionsspektren von Pyrimidinnukleosiden nach Exposition gegenüber steigender UV-Dosis bei 222 nm und 254 nm bis zu 5,0 J/cm2 mit einem Schritt von 1,0 J/cm2 vom Spektrum in Schwarz zu einem in Orange. Konzentration der wässrigen Lösungen = 50 μM und optische Weglänge = 10 mm.

RNA UpU ist ein Modellnukleotidblock für RNA. UpU (50 μg/ml) in wässriger Lösung wurde UV-bestrahlt, um die Wellenlängenempfindlichkeit gegenüber einer Schädigung von UpU und der Bildung von (6-4)PP und CPD zu beurteilen. Durch HPLC-Analyse mit Überwachung bei 258 nm wurde die Reduzierung von UpU durch Bestrahlung bei 222 und 254 nm bis zu einer Dosis von 4,5 J/cm2 gemessen, wie in Abb. 8a dargestellt. Die Abbaurate bei 222 nm war 1,9 ± 0,1-mal niedriger als bei 254 nm. Abbildung 8b zeigt, dass die Produktion von (6-4)PP aus UpU bei Bestrahlung bei 222 nm 1,5-mal größer ist als bei 254 nm, was bedeutet, dass die Produktion von (6-4)PP bei 222 nm 2,9-mal größer ist (1,9). × 1,5) effizienter als bei 254 nm. Ergänzende Abbildungen. S8 und S9 zeigen die spektralen Veränderungen von UpU durch UV-Bestrahlung bzw. HPLC-Aufklärungsprofile der Produkte. Die HPLC-Analysen zeigen, dass bei 222-nm-Bestrahlung ein schwaches CPD-Signal beobachtet wurde, bei 254-nm-Bestrahlung hingegen ein starkes. Basierend auf diesen Ergebnissen ist zu erwarten, dass die Photoreparaturausbeute von RNA, die durch Bestrahlung bei 222 nm geschädigt wurde, in einem keimtötenden Prozess gering ist.

UV-Photochemie von RNA UpU. (Blauer Kreis) 222 nm und (grüne Raute) 254 nm (a) Reduktion von UpU als Funktion der Dosis. n = 1, (b) Produktion von (6-4)PP aus UpU als Funktion der Dosis. n = 1, (c) Rückgewinnung von photohydratisiertem UpU aufgrund der Selbstreversionsreaktion bei Raumtemperatur unter dunklen Bedingungen nach UV-Bestrahlung. SD = 2 % jeder Signalintensität. n = 3.

UV-Bestrahlung von dTpdT erzeugte nur (6-4)PP bei 222 nm, während sowohl (6-4)PP als auch CPD bei 254 nm erzeugt wurden, wie in den HPLC-Aufklärungsprofilen der ergänzenden Abbildung S10 gezeigt.

Zusätzlich zu den gewöhnlichen Photoschädigungsvorgängen durch UV-Bestrahlung fügt sich ein Wassermolekül in einer nukleophilen Hydrolysereaktion an die bereits vorhandene Doppelbindung an und wird mit dem nicht hydratisierten UpU18 ins Gleichgewicht gebracht. Die reversible Reaktion von hydratisiertem UpU wurde untersucht, wobei diese Proben anschließend bis zu 120 Stunden lang bei Raumtemperatur unter dunklen Bedingungen aufbewahrt wurden. Der Selbstumwandlungsprozess von hydratisiertem UpU zu nicht hydratisiertem wurde bei einer Absorption von UpU bei 215 nm in der HPLC-Analyse überwacht. Die Aufklärungsprofile nach 254-nm-Bestrahlung sind in der ergänzenden Abbildung S11 dargestellt. Abbildung 8c zeigt die Selbstheilungskurven von UpU, die durch UV-Bestrahlung beschädigt wurden. UpU wurde durch Bestrahlung bei 254 nm mit einer Dosis von 4,5 J/cm2 bis zu einer Restschädigung von 4 % (96 % Schaden) geschädigt. Nach 120-stündiger Aufbewahrung erholte sich UpU auf einen Restwert von 68 %. Somit betrug die Rückgewinnungsmenge 64 %. Bei 222 nm und einer Dosis von 7,2 J/cm2 wurde UpU auf einen Restwert von 11 % (89 % Schaden) geschädigt, der sich auf einen Restwert von 24 % erholte. Somit betrug die Rückgewinnungsmenge 13 %.

Beachten Sie, dass die Bildung von Thyminhydraten durch 254-nm-Bestrahlung aufgrund der sterischen Hinderung durch den 5-CH3-Substituenten in Thymin eine geringe Quantenausbeute aufweist. Wie in den HPLC-Aufklärungsprofilen in der ergänzenden Abbildung S10 gezeigt, erzeugte die UV-Bestrahlung von dTpdT bei 254 nm CPD und (6-4)PP, während bei 222 nm nur (6-4)PP entstand.

Tabelle 1 fasst den Vergleich von Schäden und Produkten zusammen, die durch 222-nm- und 254-nm-Bestrahlung an Zellproteinen, Chymotripsin, Angiotensin II, Plasmid-DNA, FAD-Photoreparatur-Coenzym und Uracil/Thymin-Dimerblöcken verursacht werden.

Viren und Mikroorganismen bestehen aus Proteinen, Nukleinsäuren und Kohlenhydraten und ihre Photochemie wird durch Photoabsorptionseigenschaften bestimmt. Die schwache Absorption von Proteinen bei 254–280 nm wird von Aminosäuren dominiert und die zehnfach starke Absorption um 200 nm von der Peptidbindung2,21. Die UV-Absorption von Proteinen übersteigt die der DNA bei 220 nm und ihr Minimum liegt bei 250 nm. Eine genomische Schädigung des Adenovirus wurde durch Bestrahlung bei 254 nm induziert, während die Proteinschädigung bei 222 nm erfolgte15,16. Die 220-nm-Bestrahlung beschädigte seine Hexon- und Penton-Proteine22. Da die partielle Genanalyse seines Hexon-Proteins 22 aromatische Aminosäuren (17 Tyr, 2 Trp und 3 His) unter 242 Aminosäuren ergab23, kann UV-Bestrahlung eine direkte Lichtschädigung der Aminosäurereste hervorrufen. In der vorliegenden Studie deutet die beobachtete Wellenlängenabhängigkeit des UV-Abbaus von Chymotrypsin und Angiotensin II bei 222 nm auf einen direkten Photoprozess von His-Resten hin. Die Anfälligkeit für Photoschäden bei His bei 222 nm ist unter den aromatischen Aminosäuren am höchsten, was auf die unterschiedliche Photostabilität zwischen den Imidazol- und Phenylgruppen zurückzuführen ist. Eine Immunblotting-Analyse der viralen Spike- und Nukleokapsidproteine ​​von SARS-CoV-2 zeigte, dass die 254-nm-Bestrahlung keine Schädigung viraler Proteine ​​hervorrief13, was mit der vorliegenden Wellenlängenabhängigkeit des His-Abbaus übereinstimmt. Die 237-nm-Bestrahlung monoklonaler Antikörper oxidierte His in Modifikationsprodukten einzelner His-Reste zu Asp (und/oder iso-Asp) und Asn24. Allerdings verlief die Oxidationsreaktion von freiem His in der vorliegenden Studie mit 222-nm-Bestrahlung langsam. Diese Wellenlängenabhängigkeit in der UV-C-Photochemie von His kann durch die Tatsache erklärt werden, dass es zwei molekulare elektronische angeregte Zustände gibt, die nahe bei diesen Wellenlängen liegen, d Der -π*-Zustand ist teilweise bei längeren Wellenlängen besetzt25.

Das virale Infektiositätsspektrum entspricht dem RNA-Absorptionsspektrum im langwelligen Bereich, während es im kurzwelligen Bereich dem Proteinspektrum entspricht26,27. UV-Bestrahlung unter 240 nm schädigt virale Proteine15,22. Im Gegensatz zur Adenovirus-Desinfektion wird die UV-Desinfektion des E. coli-Bakteriophagen MS2 durch einen nichtgenomischen Mechanismus bei unter 240 nm weniger verstärkt. Dieser Unterschied ist höchstwahrscheinlich auf Unterschiede in ihren viralen Proteinen zurückzuführen. In Abb. 1 ist die keimtötende Wirkung für E. coli-Zellen bei 222 nm stärker als bei 254 nm, während in Abb. 5 die Wellenlängenwirkung für Plasmid-DNA in umgekehrter Reihenfolge verläuft. Diese Ergebnisse unterstützen den effizienten Proteinschädigungsprozess in Viren und Mikroorganismen durch 222-nm-Bestrahlung.

Nach Belichtung bei 220–300 nm mit einer Mitteldruck-Quecksilberlampe wurde aufgrund der Störung der Photolyase28 fast keine Photoreparatur von E. coli K-12 berichtet. Der Photoabbau von Proteinen und die Inaktivierung von Enzymen waren bei 222-nm-Bestrahlung viel wirksamer als bei 254-nm-Bestrahlung29. Somit ist die geringe Photoreparaturausbeute von Plasmid-DNA, die in der vorliegenden Arbeit bei 222 nm beschädigt wurde, auf den UV-Abbau von Photolyase/FAD sowie auf die geringe Ausbeute an CPD-Läsionen zurückzuführen.

Bezüglich der Selbstreversion von photoinduzierten Schäden in UpU wurde berichtet, dass nach UV-Bestrahlung von einzelsträngiger R17-RNA über eine photoinduzierte nukleophile Hydrolysereaktion, bei der Wasser durch Photosensibilisierung von Uracil30 in ein H-Atom und ein OH-Radikal gespalten wird, Uridin-Photohydrate gebildet wurden . Diese entstehenden Radikale addieren sich dann über die bereits vorhandene Doppelbindung und bilden die Hydrate. Das entstehende Hydrat-Addukt war bei 37 °C in einer neutralen wässrigen Lösung stabil, die im Gleichgewicht mit der nicht hydratisierten RNA stand. In unseren Experimenten zur UpU-Hydratisierung war die Selbstreversionsausbeute zu nicht hydratisiertem UpU während der Konservierung für UpU, das bei 222 nm bestrahlt wurde, etwa viermal niedriger als bei 254 nm. Dies könnte die keimtötende Wirksamkeit der 222-nm-Bestrahlung erhöhen. Um die keimtötende Wirksamkeit bei 254 nm für Viren zu bewerten, sollte dieser Umkehrprozess berücksichtigt werden. Beispielsweise wurde bei Überlebensmessungen von E. coli-Bakteriophagen-MS2-Zellen in Abb. 1a nach einem 24-stündigen Kultivierungsprozess im 254-nm-Bestrahlungsexperiment eine erhebliche Menge der hydratisierten Uracile selbst zu nicht hydratisierten umgewandelt, jedoch eine viel geringere Menge im 222-nm-Bestrahlungsexperiment.

Eine theoretische Berechnung für die Hydratation kartierte die Reaktionspfade, die mit der Reaktivität von U mit H2O18 verbunden sind. Die vertikalen Anregungsenergien, die mit den niedrigsten beiden elektronisch angeregten Zuständen des U + H2O-Komplexes verbunden sind, sind die elektronisch angeregten Zustände S1 bei 4,96 eV und S2 bei 5,20 eV über dem S0-Grundzustand. Der Reaktionsweg über eine minimale Energie ist ein konischer Schnittpunkt zur Bildung eines 6-HU-Hydrataddukts. Bei einer Anregung nahe der Schwelle zu S1 müssten solche Kopplungen eine Energiebarriere von 5 eV überwinden, die mit orthogonalen Kernbewegungen zu alternativen Reaktionen verbunden ist. Die UV-Photonenenergien bei 254 nm (4,9 eV) und 222 nm (5,6 eV) liegen nahe beieinander, können jedoch unterschiedliche Schnittpfade über S1 bzw. S2 induzieren. Somit hängt das Verzweigungsverhältnis der Hydratproduktion von der UV-Wellenlänge ab.

Zur Beurteilung der Zellmembranschädigung in E. coli NBRC.106373-Zellen in LB-Brühe wurde ein kommerzielles Kit (LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) als Funktion der Membranintegrität verwendet. Nach Inkubation und Zentrifugalwäsche wurden die E. coli-Zellen in PBS bei 222 und 254 nm bestrahlt. Die UV-Intensität und -Dosis betrugen 0,1 mW/cm2 bzw. 200 mJ/cm2. Die Probe wurde auf einem Agarmedium verteilt und zur Messung der Überlebenskurve 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Probe wurde außerdem mit einer im Kit enthaltenen Mischung aus SYTO9-Farbstoff und Propidiumiodid gefärbt. Die Fluoreszenz lebender oder toter E. coli K-12-Zellen wurde bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm gemessen. Die Bakterien mit intakten Zellmembranen fluoreszieren grün durch SYTO9 in den Zellmembranen, während tote Zellen mit beschädigten Membranen rot fluoreszieren, weil Propidiumiodid bei der Bindung an Nukleinsäuren rote Fluoreszenz ausstrahlt und intakte Zellmembranen nicht passiert.

Für UV-Schadenstests der Plasmid-DNA pBR322 (Takara Bio, Kusatsu, Japan) durch Bestrahlung bei 222 und 254 nm wurden kompetente E. coli HB101-Zellen Quick DH5α (DNA-913) von TOYOBO (Osaka, Japan) erworben. Bei UV-Bestrahlung von DNA 0,1 μg/ml in TE-Pufferlösungen (pH 7,5, 1 mM Tris-HCl/0,1 mM EDTA) wurden E. coli HB101-Zellen mit der Plasmid-DNA transformiert und auf LB-Agarplatten mit Ampicillin (50) kultiviert μg/ml, Nacalai Tesque, Kyoto, Japan).

Es wurde RNA-UpU hergestellt, bei dem eine Levulinylgruppe zum vorübergehenden Schutz der 3′-Hydroxylgruppe ausgewählt wurde. Die Syntheseprodukte wurden mittels Umkehrphasen-HPLC und UV-Absorptionsspektrometrie analysiert, wie in den Zusatzinformationen beschrieben. Im Protease-Experiment haben wir (1) Lösung A: α-Chymotripsin (75 μg/ml, Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) in wässriger Lösung (HCl 1 mM), (2) Lösung B: BTNPA (1,6 mg/ml) hergestellt. mL, Peptide Lab. Ibaraki, Japan) in 50 %iger wässriger DMSO-Lösung und C) Pufferlösung C: 100 mM Tris∙HCl pH8. Nachdem Lösung A bei 30 °C UV-bestrahlt wurde, wurde zur Beurteilung der UV-Hemmung der katalytischen Aktivität eine Mischung aus Lösung A (60 cm³), Lösung B (30 cm³), Lösung C (150 cm³) und Wasser (60 cm³) hinzugefügt bei einer Wellenlänge von 405 nm überwacht und das Hydratationsprodukt p-Nitroanilin untersucht. Bei Absorptionsspektralmessungen wurde der durch das reaktionsstoppende Reagenz verursachte Verdünnungseffekt berücksichtigt. Ein Oligopeptid, Angiotensin II (human)∙AcOH∙ 4H2O, wurde von Peptide Lab gekauft. (Code 4001, Ibaraki, Japan). Das HPLC-Gerät zur Analyse synthetisierter Proben und Fotoprodukte war Shimadzu Prominence mit einer Säule aus TSKgel ODS-80Ts (Tosoh, Tokio, Japan) und Lösungen von Triethylaminacetat (TEAA) und TEAA/Acetonitril. FAD und Rinderserumalbumin (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) wurden ohne weitere Reinigung verwendet. FAD wurde mit einer 4:1-Lösung (Kaliumhydrogenphosphat:Methanol) analysiert. dTpdT wurde von TriLink Biotechnologies (San Diego, USA) gekauft. Aminosäuren (Trp, Tyr, Phe, His) in wässriger Lösung. Lösungen (Nacalai Tesque) wurden durch HPLC mit wässriger Lösung gemessen. Lösung aus Acetonitril/Trifluoressigsäure (TFA) für Trp, Tyr und Phe und Natrium-1-pentansulfonsäure/Acetnitril/Phosphorsäure für His. Photoprodukte von UV-bestrahltem Angiotensin II wurden mit Lösungen von TFA und wässriger Lösung gemessen. TFA/Acetonitril. Nukleoside (A, G, C, T, U) wurden von Tokyo Kasei (Tokio, Japan) gekauft. Bei den Desinfektionsbehandlungen mit ultravioletter keimtötender Bestrahlung wurde UV-Licht verwendet, das von einer gefilterten 222-nm-KrCl-Lichtquelle mit schmalem Spektrum (222 nm, 100 μW/cm2 bei 293 mm Abstand, Ushio Inc., Tokio, Japan mit entferntem 235–280-nm-Licht) emittiert wurde Breitspektrum-254-nm-Niederdruck-Quecksilberlampe (254 nm, 100 μW/cm2 bei 330 mm Abstand). Das VUV-Spektrum wurde in Lit. angegeben. 5 und darin wurde ein UV-Messgerät beschrieben.

Eine Beschreibung der Korrektur der UV-Dosis für Proben zur Photoabsorption durch Medienlösungen und Kulturplatten finden Sie in den Zusatzinformationen. Wir beziehen uns in dieser Analyse auf die effektive Dosis. Die Entlüftung des Wassers erfolgte durch Einleiten von Stickstoffgas unter Ultraschall. Die Sauerstoffkonzentrationen betrugen 8 bzw. 0,1 mg/L vor und nach dem Entgasungsverfahren. Die Replikationszahlen N (biologisch) betragen für alle Messungen drei, sofern nicht anders angegeben, und n (technisch) waren variabel, was in den Legenden der Abbildungen beschrieben wird. Ein Experiment wurde nicht wiederholt, wenn der Unterschied zwischen den Ergebnissen bei 222- und 254-nm-Bestrahlung deutlich war.

Die Datensätze, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels stützen, sind im Artikel und in den Zusatzinformationen enthalten. Wenn Leser weitere Informationen zu den Daten wünschen, wenden Sie sich bitte an KN

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Masahiro Kawasaki

Aktuelle Adresse: Arctic Research Center, Universität Hokkaido, Sapporo, 001-0021, Japan

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Keisuke Naito

Carbuncle Bioscientech Inc., Yoshida-Kawaramachi, Kyoto, 606-8305, Japan

Kazuyuki Sawadaishi

Abteilung für Molekulartechnik, Universität Kyoto, Kyoto, 615-8530, Japan

Masahiro Kawasaki

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KN und KS führten die Experimente durch und analysierten die Daten; KN und MK betreuten die Studien und leisteten konzeptionelle Ratschläge. Alle Autoren haben an der Erstellung des Manuskripts mitgewirkt.

Korrespondenz mit Keisuke Naito oder Masahiro Kawasaki.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Naito, K., Sawadaishi, K. & Kawasaki, M. Photobiochemische Mechanismen von Biomolekülen, die für keimtötende ultraviolette Bestrahlung bei 222 und 254 nm relevant sind. Sci Rep 12, 18217 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22969-5

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Eingegangen: 07. Juli 2022

Angenommen: 21. Oktober 2022

Veröffentlicht: 29. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22969-5

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