Identifizierung einer tiefen

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4354 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Es wurde vermutet, dass frühe Bakterien oder sogar der letzte universelle gemeinsame Vorfahre aller Zellen thermophil waren. Die Erforschung des Ursprungs und der Entwicklung der Thermophilie wird jedoch durch die Schwierigkeiten erschwert, die mit der Isolierung tiefverzweigter thermophiler Mikroorganismen in Reinkultur verbunden sind. Hier isolieren wir ein tief verzweigtes thermophiles Bakterium aus einem hydrothermalen Tiefseeschlot mithilfe einer zweistufigen Kultivierungsstrategie („Subtraction-Suboptimal“, StS), die darauf ausgelegt ist, seltene Organismen zu isolieren. Das Bakterium, das wir Zhurongbacter thermophilus 3DAC nennen, ist ein schwefelreduzierender Heterotropher, der phylogenetisch mit Coprothermobacterota und anderen thermophilen Bakteriengruppen verwandt ist und eine Klade bildet, die eine große, früh divergierende Bakterienlinie darzustellen scheint. Der Vorfahr dieser Gruppe könnte ein thermophiles, streng anaerobes, bewegliches, wasserstoffabhängiges und mixotrophes Bakterium sein. Somit liefert unsere Studie Einblicke in die frühe Evolution thermophiler Bakterien.

Organismen mit optimalen Wachstumstemperaturen über 45 °C werden als Thermophile bezeichnet1,2. Diese Thermophilen kommen allgegenwärtig in natürlichen oder künstlichen Umgebungen mit hohen Temperaturen vor, wie z. B. terrestrischen Vulkanstandorten, heißen Quellen, Unterwasser-Hydrothermalsystemen, tiefen Unterwasserböden, Ölreservoirs, solarbeheizten Oberflächenböden und industriellen Inkubatoren3,4,5,6,7, 8. Einige Thermophile können auch unter alkalischen, sauren oder stark salzhaltigen Bedingungen leben, was ihre Fähigkeit unterstreicht, mehrere Stressfaktoren zu tolerieren9,10. Diese sogenannten „extremen Umgebungen“ gelten im Allgemeinen als Analogien zu den Bedingungen auf der frühen Erde, als das Leben im späten Hadäischen oder frühen Archaischen Zeitalter entstand11,12, und mehrere experimentelle Studien13,14 und geologische Beweise15 stützten die frühe Entstehung von Thermophilen.

Thermophile Bakterien kommen in einer Vielzahl von Bakterienstämmen vor, doch nur wenige Stämme enthalten fast ausschließlich thermophile Bakterien, nämlich Aquificota, Dictyoglomota, Coprothermobacterota, Thermotogota und Thermodesulfobiota. Während vermutet wurde, dass Thermophilie ein uraltes Merkmal von Bakterien oder sogar Leben darstellen könnte16,17,18,19,20, vertreten andere Hypothesen einen nicht-thermophilen Ursprung von Bakterien und platzierten Bakterienlinien wie Chloroflexota oder den Kandidaten Phyla Radiation (CPR) in der Nähe der Wurzel des bakteriellen Stammbaums21,22,23. Eine kürzlich durchgeführte Studie, bei der ein fremdgruppenfreier Genbaum-Arten-Baum-Versöhnungsansatz verwendet wurde, verwarf zuvor vorhergesagte Bakterienwurzeln und platzierte eine neue robuste Wurzel zwischen zwei Hauptbakterienzweigen, nämlich Gracilicutes und Terrabacteria, obwohl Unsicherheiten hinsichtlich der phylogenetischen Position der Fusobacteriota-Linie bestehen24 . Dennoch bleibt unklar, wann die thermophilen Bakterien entstanden und wie sich ihr Stoffwechsel entwickelte.

Das vorhergesagte Stoffwechselpotenzial des letzten gemeinsamen Vorfahren der Bakterien (LBCA) oder der frühen divergierenden Bakterienlinie kann Aufschluss über die frühen Lebensräume der Erde und das frühe Ökosystem geben20,25,26,27,28. Für thermophile Bakterien zeigten mehrere frühere Studien, die sich auf verschiedene Abstammungslinien wie Thermotogota29, Aquificota30 und Coprothermobacterota31 konzentrierten, eine komplexe Evolutionsgeschichte mit einem hohen Anteil an Genen, die horizontal von anderen Prokaryoten übertragen wurden. Es fehlt jedoch immer noch an einer Evolutionsstudie, die auf umfassenden vergleichenden Genomanalysen der wichtigsten thermophilen Bakteriengruppen basiert. Auch wenn kultivierungsfreie metagenomische Analysen unser Wissen über die Bakterienvielfalt erheblich erweitert haben32,33, erfordert die Forschung an thermophilen Bakterien immer noch, dass isolierte Stämme einen direkten Nachweis ihrer Physiologie erbringen, beispielsweise eine optimale Wachstumstemperatur, um ihre thermophilen Eigenschaften zu bestätigen. Dennoch ist es äußerst schwierig, rein kultivierte neuartige thermophile Bakterien zu erhalten, insbesondere für tief verzweigte Bakterienstämme.

Hier berichten wir über die Entdeckung und Isolierung eines neuartigen thermophilen, piezophilen, schwefelreduzierenden Bakterienstamms, Zhurongbacter thermophilus 3DAC. Phylogenomische Studien des Stammes 3DAC zeigen, dass er eng mit den wichtigsten thermophilen Bakteriengruppen wie Coprothermobacterota, Dictyoglomota, Caldisericota und Thermotogota verwandt ist. Phylogenetische Ahnenanalysen deuten darauf hin, dass diese dicht geclusterten thermophilen Bakterienlinien einen letzten gemeinsamen Vorfahren haben, der das Potenzial hat, Wasserstoff und Schwefelverbindungen zu metabolisieren, und über einen mixotrophen Kohlenstoffkatabolismus verfügt.

Um die Wahrscheinlichkeit der Kultivierung neuartiger thermophiler Bakterien aus der seltenen Biosphäre zu erhöhen, haben wir eine zweistufige Kultivierungsstrategie mit der Bezeichnung „Subtraction-Suboptimal“ (StS)-Strategie entwickelt (Abb. 1c). Das Konzept dieser Methode besteht darin, die Komplexität der Gemeinschaft zu reduzieren und die Häufigkeit dominanter heterotropher Organismen zu minimieren, indem zunächst ein autotrophes Kulturmedium verwendet und mehrere Male subkultiviert wird (bezeichnet als „Subtraktion“), gefolgt von einem Wechsel zu einem reichhaltigen heterotrophen Medium suboptimale Temperatur, um die in geringer Menge vorhandenen heterotrophen thermophilen Zielbakterien wiederherzustellen und die Konkurrenz durch normalerweise dominante, schnell wachsende hyperthermophile heterotrophe Archaeen zu vermeiden (bezeichnet als „suboptimal“).

a Lage des L-Schlots im 9°N-Schlotfeld auf dem East Pacific Rise. Die Karte wurde von Ocean Data View (Schlitzer, Reiner, Ocean Data View, https://odv.awi.de, 2021) erstellt. b Die schwarze L-Entlüftungsschornsteinprobe, gesammelt in einem anaeroben Röhrchen. c Schematische Darstellung der „Subtraction-Suboptimal“ (StS)-Strategie, die in dieser Studie zur Isolierung des Zhurongbacter thermophilus-Stammes 3DAC verwendet wurde. d Die Verfolgung der Anteilsänderungen von 3DAC-nah verwandten Sequenzen in der Schornsteinprobe, der ursprünglichen Anreicherung und verschiedenen Transfers. Etiketten: Schornstein, die Schornsteinprobe; CH8-50C-S0, ursprüngliche Anreicherung; CH8-50C-S1 bis -S5, die ersten bis fünften Subkulturen, die aus der ursprünglichen Anreicherung übertragen wurden. Alle Proben weisen darauf hin, dass der Stamm 3DAC eine seltene Art darstellt. e Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von 3DAC, in der 3DAC-Zellen lange Filamente mit Ketten von bis zu 11 Zellen oder mehr bilden; die mikroskopische Aufnahme zeigt eine Verbindung zwischen zwei 3DAC-Zellen; und ein langes seitliches Flagellum von 3DAC. Das TEM-Experiment wurde viermal wiederholt und jedes Mal wurden lange filamentöse Muster beobachtet. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

In diesem Fall wurde die ursprüngliche Probe, die aus einem aktiven schwarzen Raucherschornstein entnommen wurde, der hydrothermale Flüssigkeit mit einer Temperatur von 231 °C abgibt (Abb. 1a, b; Lit. 34), zunächst in einem chemolithoautotrophen Medium (SME-Medium, siehe „ Methoden“) bei 50 °C, dann fünfmal hintereinander unter autotrophen Bedingungen übertragen, wodurch die Komplexität der mikrobiellen Gemeinschaft und der Anteil an Heterotrophen reduziert werden. Die Bedingungen der chemoautotrophen „Subtraktions“-Stufe ahmten die natürliche Umgebung vor Ort nach und bildeten eine Gemeinschaft, die von Autotrophen dominiert wurde (hauptsächlich Hydrogenimonas innerhalb von Campylobacterota und Desulfurobacterium innerhalb von Aquificota)35. Die Leistung ähnelte der herkömmlichen Anreicherungsmethode, indem der Anteil der Heterotrophen verringert wurde, wobei die Heterotrophen zusammen mit den Autotrophen kultiviert wurden. Obwohl die Gemeinschaft durch die „Subtraktionsphase“ vereinfacht wird, bleibt im Allgemeinen ein gewisses Maß an Vielfalt erhalten, was mehr Möglichkeiten für die Isolierung seltener Arten bietet, die durch Autotrophen unterstützt werden.

Für das „Suboptimal“-Stadium haben wir die Kultivierungsbedingungen vom autotrophen Medium auf ein heterotrophes Medium umgestellt, um eine starke Selektion für Heterotrophe zu ermöglichen. Allerdings haben wir die Kultivierungstemperatur von 50 auf 45 °C gesenkt. Während dies zu einer suboptimalen Wachstumstemperatur für thermophile Bakterien führte, verhinderte es das Wachstum heterotropher hyperthermophiler Archaeen (z. B. Thermococcus, Wachstumstemperatur liegt zwischen 50 und 100 °C36), die in der Schornsteinprobe weit verbreitet waren, was die Gewinnung seltener heterotropher Bakterien ermöglichte thermophile Bakterien. Nach einer viertägigen Inkubation wurde Wachstum beobachtet, gefolgt von der Isolierung einzelner transparenter und runder Kolonien mithilfe der Rollrohrmethode37, die ein festes TRM-Medium enthielt.

Während der „Subtraktionsphase“ können einige heterotrophe Arten mit geringer Häufigkeit, die zusammen mit den Autotrophen kultiviert werden, erhalten bleiben. Diese seltenen Arten können mit herkömmlichen Methoden kaum isoliert werden, wenn gleichzeitig schnell wachsende heterotrophe Mikroorganismen vorhanden sind. Die erfolgreiche Isolierung des Stammes 3DAC, der im fünften Transfer der chemoautotrophen Anreicherung nur ~0,001 % der Gesamtgemeinschaft ausmachte (~0,2 % in der Schornsteinprobe, Abb. 1d), unterstreicht das Potenzial der „StS“-Strategie seltene Arten aus Umweltproben isolieren.

Hier stellen wir eine neue Idee einer zweistufigen Strategie vor, um die Isolierung seltener oder unbekannter Arten zu erreichen, die eine ähnliche ökologische Nische wie eine dominante Gruppe haben. Der „Subtraktion“-Prozess führt innerhalb einer Gemeinschaft zu einer Verdünnung bis zur Ausrottung, um die mikrobielle Zusammensetzung zu vereinfachen, und der „Suboptimal“-Prozess gewinnt die seltenen Arten durch den suboptimalen Zustand zurück, der für die dominierende Gruppe in einer ähnlichen ökologischen Nische schädlicher ist . Diese „StS“-Strategie bietet möglicherweise neue Möglichkeiten, seltene Taxa zu entdecken, die sich hinter den häufig vorkommenden dominanten Taxa in untersuchten Umgebungen verbergen.

Die Zellen des Stammes 3DAC sind stäbchenförmig, 1,3–7,5 μm lang (durchschnittlich 3,1 ± 1,3, n = 25) und 0,4–0,6 μm breit (durchschnittlich 0,5 ± 0,07, n = 25). Sie haben ein einzelnes seitliches Flagellum und sind unter einem Lichtmikroskop sehr beweglich. Während des Wachstums kommt der Stamm 3DAC meist als einzelne Zellen vor, bildet jedoch manchmal lange Ketten (Abb. 1e und ergänzende Abb. 1). Der Stamm 3DAC wächst nur unter streng anaeroben Bedingungen und verhält sich als piezophiler Thermophiler mit: Temperaturbereich von 30–75 °C (optimal 70 °C), NaCl-Bereich von 1,0–4,5 % (w/v) (optimal 2,5 %), pH-Bereich von 5,5–8,5 (optimaler pH-Wert 7,0) und hydrostatischer Druckbereich von 0,1–80 MPa (optimal 20 MPa) (Ergänzende Abbildung 2a–d).

Die getrennte Zugabe von Pepton, Casaminosäuren, Rindfleischextrakt, Hefeextrakt und Trypton in einer Endkonzentration von 0,2 % (Gew./Vol.) unterstützte das schnelle Wachstum des Stamms 3DAC (ergänzende Abbildung 2e). In einem TRM-Basismedium ohne Kohlenstoffquelle wurde unter den getesteten Bedingungen kein Wachstum festgestellt, wenn nur eine Art von Kohlenhydrat oder organischer Säure separat zugegeben wurde (siehe „Methoden“). Der Stamm 3DAC wuchs jedoch gut, wenn 20 kanonische Aminosäuren gleichzeitig zum TRM-Basismedium hinzugefügt wurden. Darüber hinaus ergaben „Leave-One-out“-Experimente mit 20 Aminosäuren, dass 3DAC auf 11 essentiellen Aminosäuren beruhte (d. h. L-Arginin, L-Cystein, L-Histidin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Threonin, L-Tryptophan und L-Tyrosin) (Abb. 2b) wurde kein Wachstum beobachtet, da keine dieser Aminosäuren fehlte. In Gegenwart von 20 Aminosäuren können D-(+)-Glucose und Pyruvat als zusätzliche Kohlenstoffquellen verwendet werden (Abb. 2b und ergänzende Daten 1).

a Schematische Darstellung des energetischen Prozesses im Stamm 3DAC. Rote Formen stellen archaische Orthologe dar. Graue Formen stellen bakterielle Orthologe dar. Durchgezogene Linien stellen enzymatische Reaktionen dar. Gepunktete Linien stellen abiotische Reaktionen dar. Differenziell exprimierte Gene wurden mit DESeq2 (Version 1.12.4) identifiziert. Es wurde die standardmäßige DESeq-Funktion mit betaPrior = FALSE angewendet, wobei ein negatives binomiales verallgemeinertes Modell mit Wald-Signifikanztest durchgeführt wurde. Die zweiseitigen p-Werte wurden für Mehrfachtests mit der Benjamini-Hochberg-Methode korrigiert. Blaue Pfeile zeigen eine signifikante Hoch- oder Herunterregulierung mit Schwefel im Kulturmedium basierend auf transkriptomischen Daten an [n = 3 pro Behandlung, log2 (fache Änderung) > 1, P-Wert < 0,05] (Ergänzende Daten 1). Diese Figur wurde mit BioRender (https://biorender.com/) erstellt. b Wachstumsfähigkeiten auf verschiedenen Kohlenstoffquellen der Belastung 3DAC. Computervorhersagen wurden mit dem Stoffwechselmodell im Genommaßstab von 3DAC (Supplementary Data 1) simuliert. „20aa“: alle 20 Aminosäuren ergänzt als einzige Kohlenstoffquelle. „20aa-X“: Entfernung einzelner Aminosäuren X. „20aa+Y“: zusätzliche Kohlenstoffquelle Y, versorgt mit 20 Aminosäuren. „+“: ähnliche Wachstumserträge im Vergleich zum 20aa-Zustand; „++“: mindestens 1,5-fach höhere Wachstumserträge als 20aa; "-": kein Wachstum. c Sulfidkonzentration und OD600 während des Wachstums des Stammes 3DAC. S: Medium mit elementarem Schwefel; NS: kein elementarer Schwefel. Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen (SDs) von unabhängigen biologischen Triplikaten (n = 3) während der Experimente unter 0,1 MPa dar. Die Daten werden als Durchschnittswerte ± SD dargestellt. d Experimentelle und rechnerische Wachstumsausbeuten des 3DAC-Stammes durch Verwendung verschiedener Schwefelspezies. In der Versuchsgruppe stellen Fehlerbalken die Standardabweichungen (SDs) von unabhängigen biologischen Duplikaten (n = 2) während der Experimente unter 0,1 MPa dar. Die Daten werden als Durchschnittswerte ± SD dargestellt. e Simulationen von Wildtyp-3DAC (WT), einfachen Deletionen (-MBS, -Nfn2, -SH1), doppelten Deletionen (-MBS-Nfn2, -MBS-SH1 und -Nfn2-SH1) und dreifachen Deletionen (-MBS-Nfn2). -SH1) von Archaeen-abgeleiteten Komplexen in energetischen Prozessen am 3DAC. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Das vollständige Genom des Stammes 3DAC ist ein einzelnes kreisförmiges Chromosom von 1.588.679 bp mit einem GC-Gehalt von 41,15 % (ergänzende Abbildung 3). Das 3DAC-Genom enthält drei rRNA-Genoperons und 46 tRNA-Gene. Insgesamt können 1524 kodierende DNA-Sequenzen (CDS) mit einer durchschnittlichen Länge von 980,78 bp identifiziert werden, die 94,09 % des gesamten Genoms abdecken. Der Stamm 3DAC verfügt über einen vollständigen Glykolyseweg, was auf die Fähigkeit zur Kohlenhydratverwertung schließen lässt. Allerdings fehlen viele Gene, die mit der Aminosäuresynthese in Zusammenhang stehen, was auf den Bedarf an bestimmten Aminosäuren hinweist. Dieses Phänomen wird durch Ergebnisse physiologischer Experimente bestätigt, das Wachstum von 3DAC hängt von der Zugabe von Aminosäuren ab und kann durch die Zugabe von Kohlenhydraten stimuliert werden (Abb. 2b). Der Verlust von Genen im Zusammenhang mit der Aminosäuresynthese kommt bei Thermophilen häufig vor. Da die Synthese von Aminosäuren viel Energie verbraucht38, ist es für Thermophile effizienter, Aminosäuren direkt aus der Umgebung aufzunehmen, was ihrer Anpassung an die hydrothermale Umgebung förderlicher ist.

Der respiratorische Energieprozess im Stamm 3DAC enthält eine Na+-gesteuerte ATP-Synthase (ergänzende Abbildung 4), einen 12-Gen-Cluster, der einen membrangebundenen wasserstoffproduzierenden Komplex (MBH) kodiert, und einen 13-Gen-Cluster, der den membrangebundenen Schwefel kodiert Atmungskomplex (MBS), der dem energetischen Prozess in hyperthermophilen Archaeen innerhalb der Ordnung Thermococcales39,40,41 ähnelt (Abb. 2a). MBS ermöglicht es Zellen, elementaren Schwefel (S0) in vivo zu Schwefelwasserstoff (H2S) zu reduzieren und reduziertes Ferredoxin als Elektronendonor zu verwenden40. Gene im MBH von 3DAC, einschließlich der katalytischen Schlüsseluntereinheit der Wasserstoffproduktion (MbhL), sind erwartungsgemäß bakterielle Orthologe, während die meisten MBS-kodierenden Gene (10 von 13) von 3DAC archaische Orthologe sind, die den gesamten Membranarm (MbsA) kodieren , B-, C-, D-, E-, G-, H-, H'- und M-Untereinheiten) und die katalytische Schlüsseluntereinheit der Schwefelreduktion (MbsL) (Abb. 2a und ergänzende Daten 1). Im Vergleich zum bakteriellen wasserstoffproduzierenden MBH ermöglicht das aus Archaeen gewonnene MBS den Zellen eine effizientere Energieumwandlung mit einem 3,4-fach höheren Redoxpotential zur Reduzierung von elementarem Schwefel (S0) zu Schwefelwasserstoff (H2S) als MBH39,40. Darüber hinaus sind zwei redoxausgleichende Komplexe in 3DAC, lösliche Hydrogenase I (SH1) und NADP-abhängige Ferredoxin-Oxidoreduktase II (Nfn2), ebenfalls archaeale Orthologe mit einer hohen Identität (>60 %) als Gene, über die in hyperthermophilen Archaeen Thermococcales berichtet wurde 42, 43 .

In Übereinstimmung mit der Genomanalyse zeigten physiologische Experimente, dass die Anwesenheit von elementarem Schwefel das Wachstum des Stammes 3DAC im Vergleich zum Medium ohne Schwefel signifikant stimulierte (Abb. 2c, d). Andere Schwefelersatzstoffe wie Natriumsulfat, Natriumthiosulfat, L-Cystein oder L-Methionin stimulierten das Wachstum nicht signifikant (Abb. 2d und ergänzende Daten 1). Während des Wachstums von 3DAC wird elementarer Schwefel zu Sulfid reduziert (Abb. 2c). Es wird vorgeschlagen, dass dieser Prozess von MBS mit Hilfe des Redoxausgleichs über Nfn2 und/oder SH1 durchgeführt wird, was auch mit der Transkriptomanalyse mit oder ohne elementarem Schwefel übereinstimmt. Wir fanden heraus, dass die meisten Gene (10 von 13) in MBS durch elementaren Schwefel im Medium deutlich hochreguliert waren, einschließlich der katalytischen Untereinheit MbsL. Gene in Nfn2 wurden auch stark mit Schwefel exprimiert, was auf eine mögliche Kopplung von Nfn2 mit MBS zum Redoxausgleich hinweist. Im Gegensatz dazu wurden die Gene in MBH und SH1 in Gegenwart von Schwefel erheblich herunterreguliert, was auf eine Konkurrenz zwischen MBS und MBH und eine mögliche Kopplung zwischen MBH und SH1 schließen lässt (Supplementary Data 1).

Darüber hinaus wurde ein Stoffwechselmodell von 3DAC im Genommaßstab, GEM-i3DAC (Supplementary Data 1), erstellt, um die Auswirkungen der von Archaeen abgeleiteten Atmungs- und Redoxausgleichskomplexe (dh MBS, SH1 und Nfn2) in 3DAC zu simulieren. Das Modell umfasste sowohl Anmerkungen aus automatischen Pipelines als auch manuell kuratierte biochemische Beweise für (Hyper-) Thermophile aus der Literatur (Supplementary Data 1). Dieses Modell wurde validiert, um Wachstumstrends genau vorherzusagen, indem im Vergleich zu den experimentellen Beobachtungen verschiedene Kohlenstoffquellen und Elektronenakzeptoren verwendet wurden (Abb. 2b, d). Darüber hinaus wurden Simulationen an den 3DAC-Wildtyp-, Einzel-, Doppel- und Dreifachdeletionen der von Archaeen abgeleiteten Komplexe MBS, SH1 und Nfn2 durchgeführt. Die Entfernung von MBS blockierte den Schwefelverbrauch und die Schwefelwasserstoffproduktion und verringerte theoretisch die maximalen Biomasseerträge auf 33 % des WT (Abb. 2e und ergänzende Daten 1), was die Notwendigkeit von MBS für die Nutzung von Schwefel als Elektronenakzeptor zur Stimulierung des 3DAC-Wachstums untermauerte. Die einzelne Deletion von Nfn2 und SH1 verringerte den maximalen Fluss der ATP-Synthase auf 72 % bzw. 50 %, was auf die wesentliche Funktion von Nfn2 und SH1 bei der ATP-Produktion hinweist. Diese Ergebnisse zeigten die Notwendigkeit dieser von Archaeen abgeleiteten Komplexe sowohl für das Wachstum als auch für die ATP-Produktion im 3DAC-Stamm. Insgesamt fungierte der Stamm 3DAC als thermophiler Heterotropher, der aus Bakterien stammende wasserstoffproduzierende und aus Archaeen stammende schwefelreduzierende Komplexe für die Atmung kombinierte. Die Fähigkeit des thermophilen Stammes 3DAC, die Energieproduktion aus Archaeen zu nutzen, könnte ein Hinweis auf seine entscheidende Rolle in der Evolution sein.

Die phylogenetische Analyse auf der Grundlage verschiedener verketteter konservierter Proteinsequenzen24,44,45,46 und die auf dem 16S-rRNA-Gen basierende Analyse weisen beide auf die phylogenetische Position des Stammes 3DAC als Schwesterlinie von Coprothermobacterota hin, einem von Pavan et al. vorgeschlagenen Bakterienstamm. (2018) 47 (Abb. 3a–c und ergänzende Abb. 5a–c). Der am engsten verwandte kultivierte Stamm von 3DAC, der sowohl auf phylogenetischen als auch auf phylogenomischen Analysen des 16S-rRNA-Gens basiert, war Coprothermobacter proteolyticus DSM5265, weist jedoch eine niedrige 16S-rRNA-Genidentität (81, 25–83, 00 %) und AAI (48–49 %) auf (Ergänzungsdaten 3 und 4). ). C. proteolyticus DSM5265 ist eine anaerobe thermophile Mikrobe, die häufig in künstlichen thermophilen anaeroben Systemen gefunden wird. Sie wächst besser ohne Natriumchlorid und ist in der Lage, Thiosulfat zu Sulfid zu reduzieren31,48,49,50, während 3DAC aus der natürlichen hydrothermalen Quelle isoliert wurde und eine Bevorzugung der Verwendung von Aminosäuren und elementarem Schwefel. Die phylogenetische Analyse der 16S-rRNA-Gene zeigt, dass der Stamm 3DAC zusammen mit anderen verwandten 16S-rRNA-Genen aus Anreicherungskulturen aus Röhren von Alvinella pompejana, die aus einem Tiefseeschlot bei 13° N am Ostpazifik-Rücken gesammelt wurden, eindeutig einen monophyletischen Cluster bildet Trennung von Coprothermobacterota (ergänzende Abbildung 5c). Wir haben auch fast vollständige 16S-rRNA-Gensequenzen (länger als 1400 bp, >95 % Abdeckung) aus Coprothermobacterota zusammengestellt und die Sequenzidentitäten mit denen der 3DAC-Klade verglichen. Die Identitäten der 16S-rRNA-Gensequenzen lagen zwischen 75,73 und 83,00 % (Supplementary Data 5). Da der Stamm 3DAC aus einer hydrothermalen Hochtemperaturumgebung isoliert wurde, schlagen wir 3DAC als Zhurongbacter thermophilus 3DAC vor, benannt nach Zhurong, dem Feuergott im chinesischen Mythos. Für eine höhere taxonomische Klassifizierung, basierend auf den vorgeschlagenen AAI-Bereichen für die Identitäten des gesamten Genoms51 und der mittleren 16S-rRNA-Gensequenz52 zur Unterscheidung eines neuen Stammes, ist es wahrscheinlich, dass diese Abstammungslinie einen bisher unbekannten thermophilen Bakterienstamm darstellt. Der relative evolutionäre Divergenzwert (RED) des Stammes 3DAC weist jedoch darauf hin, dass 3DAC auf der Grundlage der GTDB-Taxonomie53 zu einer Abstammungslinie auf Klassenebene innerhalb des Stammes Coprothermobacterota gehören könnte. Es besteht eine Diskrepanz zwischen der traditionellen Klassifikation und der GTDB. Daher bezeichnen wir die durch 3DAC dargestellte Gruppe hier nur vorübergehend als tief verzweigte Abstammungslinie Zhurongbacterota, bis weitere 3DAC-verwandte Arten für eine genauere taxonomische Bewertung sowie die prokaryotische taxonomische Definition entdeckt werden des Stammes einen Konsens innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinschaft erzielen.

ein phylogenomischer Baum von Zhurongbacter thermophilus 3DAC und anderen wichtigen thermophilen Bakterien unter Verwendung von Archaea als Außengruppe mit 16 konservierten Single-Copy-Proteinsequenzen (CSCP) mit IQ-Tree unter Verwendung des LG + R10 + C60-Modells. b Phylogenombaum von Zhurongbacter thermophilus 3DAC und anderen wichtigen thermophilen Bakterien unter Verwendung von 16/37/62 konservierten Proteinsequenzen. Die rote Farbe repräsentiert die wichtigsten thermophilen Bakterienstämme, nämlich Zhurongbacterota, Caldisericota, Coprothermobacterota, Dictyoglomota, Thermotogota und Thermodesulfobiota. Die rosa Farbe bezieht sich auf Aquificota, Synergistota und Deinococcota, während sich die violette Farbe auf Fusobacteriota bezieht. c Phylogenomische Schlussfolgerungen der Abstammungslinien aus dem CCTB mit 37 konservierten Proteinsequenzen mit unterschiedlichen Modellen, jedoch ohne das Archaea-Genom. I-VI repräsentieren Thermotogota, Thermodesulfobiota, Dictyoglomota, Caldisericota, Zhurongbacterota und Coprothermobacterota. Die Pfeile deuten auf andere Bakterienzweige hin. In allen Bäumen weisen die grauen Quadrate auf einen Bootstrap von mehr als 0,8 hin.

Eine phylogenetische Analyse basierend auf verschiedenen Sätzen der verketteten konservierten Proteinsequenzen mit unterschiedlichen Inferenzmodellen ergab, dass der Stamm 3DAC zusätzlich zu Coprothermobacterota31,47,50 am engsten mit anderen thermophilen Bakteriengruppen verwandt ist, d. h. Caldisericota54,55, Dictyoglomota56, Thermotogota16, 57,58 und Thermodesulfobiota44,47,59,60,61,62,63 (Abb. 3a – c). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren phylogenetischen Studien überein, bei denen verschiedene Proteinhersteller eingesetzt wurden55,64. Alle fanden heraus, dass sich diese thermophilen Bakterienlinien zusammenballten. Dennoch stellten wir fest, dass der auf dem 16S-rRNA-Gen basierende phylogenetische Baum mehrere nicht thermophile Bakterienstämme innerhalb einer Klade platziert, die wir als „eng gruppierte thermophile Bakterien“ (CCTB) bezeichnen (ergänzende Abbildung 5a, b). Der phylogenetische Konflikt zwischen dem 16S-rRNA-Gen und verketteten konservierten Proteinsequenzen kann durch mögliche phylogenetische Artefakte verursacht werden, die sich aus einer kompositorischen Verzerrung des 16S-rRNA-Gens ergeben, wie in früheren Studien gezeigt wurde65,66,67,68, die die Evolution möglicherweise nicht genau widerspiegeln Geschichte der thermophilen Abstammungslinien. Im Gegenteil, verkettete Alignments mehrerer universell verteilter Einzelkopie-Markergene haben in Evolutionsanalysen zunehmend an Bedeutung gewonnen, da sie eine höhere Auflösung bieten und einen größeren Teil des Genoms abdecken als einzelne Markersequenzen69.

Wir haben ihre phylogenetischen Positionen auch mit zwei Wurzeldatensätzen außerhalb der Gruppe getestet, d. h. mit Archaea als Außengruppe und mit der in Lit. vorgeschlagenen bakteriellen Wurzelposition. 24. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich diese thermophilen Gruppen durchweg in der Nähe der Wurzel des phylogenomischen Archaea-Bacteria-Baums ansammeln oder eine tief verzweigte Monophyse mit der Schwestergruppe Terrabacteria aufweisen, indem sie jeweils die beiden Wurzelbildungsmethoden anwenden (Abb. 3a, b). Physiologisch gesehen haben alle oben genannten Bakterienstämme auch ähnliche Stoffwechselfähigkeiten, zum Beispiel führen fast alle ihrer Stämme einen anaeroben Lebensstil, sind in der Lage, elementaren Schwefel oder schwefelverwandte Verbindungen zu nutzen und sind Heterotrophe mit der Fähigkeit, Zucker abzubauen oder/und Proteine ​​(Ergänzende Daten 6). Daher bezeichnen wir diese Gruppe hier als „eng geclusterte thermophile Bakterien (CCTB)“, um diese thermophilen Bakterienstämme zu beschreiben, die sich eng mit 3DAC zusammenschließen und sich auf bakteriellen Stammbäumen verzweigen. Das CCTB enthält mindestens sechs Abstammungslinien mit rein kultivierten Stämmen: Zhurongbacter, Caldisericota, Coprothermobacterota, Dictyoglomota, Thermotogota und Thermodesulfobiota. Einige andere Kandidatenstämme wie Deinococcota und Synergistota bilden ebenfalls Cluster mit der Klade (Abb. 3a) und könnten daher zur CCTB gehören. Obwohl einige ihrer Mitglieder ebenfalls thermophile Bakterien sind, haben diese Stämme mehrere Abstammungslinien nicht-thermophiler Bakterien entwickelt70,71,72. Darüber hinaus gruppieren sich einige Kandidatenstämme mit dem CCTB im 16S-rRNA-Genbaum, weisen jedoch eine gewisse Inkonsistenz im phylogenomischen Baum auf, wenn sie verschiedene konservierte Markerproteinsequenzsätze verwenden, wie z. B. thermophile Aquificota. Wir haben die Phylogenie von Aquificota mit verschiedenen Methoden sorgfältig überprüft und festgestellt, dass die meisten Gene in Aquificota einen horizontalen Gentransfer (HGT) durchlaufen haben, wie zuvor beschrieben 73, 74 (Ergänzende Abbildungen 6 und 7), was die phylogenetische Schlussfolgerung beeinflussen würde. Im Allgemeinen müssen in Zukunft weitere Untersuchungen darüber durchgeführt werden, ob die Stämme Deinococcota, Synergistota, Aquificota und sogar andere eng verwandte Gruppen einen thermophilen Ursprung haben und sich als Schwesterlinien mit CCTB verzweigen.

Phylogenetische Ahnenanalysen deuten darauf hin, dass die Mitglieder des CCTB (Zhurongbacter, Caldisericota, Coprothermobacterota, Dictyoglomota, Thermotogota und Thermodesulfobiota) möglicherweise einen letzten gemeinsamen Vorfahren hatten. Der vorhergesagte Stammgensatz aus sechs Abstammungslinien umfasst im Allgemeinen Gene, die für thermophile Komponenten (mutmaßliche Hitzeschockproteine), Flagellen, die ihre Bewegung ermöglichen, Hydrogenase (FeFe-Gruppentyp) sowie Saccharid- und Aminosäureverwertungswege kodieren ( ALE vorhergesagte Genkopienzahl > 0,3, Zusatzdaten 2). Dennoch sind die Biosynthesewege der Aminosäuren nicht vollständig, was möglicherweise auf die Einschränkung der Vorfahrenvorhersage zurückzuführen ist. Darüber hinaus wurde ein Stoffwechselmodell des CCTB-Vorfahren im Genommaßstab erstellt, das darauf schließen lässt, dass es sich um ein bewegliches mixotrophes Bakterium mit Kohlendioxid, Sacchariden und Proteinen als Substraten handelt (Ergänzungsdaten 2). Dieser vorhergesagte angestammte Stoffwechsel des CCTB-Vorfahren weist auch viele Ähnlichkeiten mit den kürzlich abgeleiteten Stoffwechselkapazitäten des letzten universellen gemeinsamen Vorfahren (LUCA) und LBCA20,24,75 auf. Die CCTB-Vorfahren LUCA und LBCA gelten als streng anaerobe Mikroorganismen. Es wird vorhergesagt, dass sowohl der CCTB-Vorfahre als auch LUCA thermophil sind und das Potenzial zur Metabolisierung von Wasserstoff teilen, während LBCA und der CCTB-Vorfahre die Vorhersagen hinsichtlich der Motilität und des Potenzials zum Abbau organischer Kohlenstoffverbindungen teilen.

Innerhalb der CCTB-Klade passte sich nach der Diversifizierung des CCTB-Vorfahren jede Linie an unterschiedliche Umgebungen an und entwickelte sich schrittweise weiter, um durch Gengewinn und -verlust spezifische Merkmale zu bilden (Abb. 4 und ergänzende Abb. 8), insbesondere im Hinblick auf den Schwefelstoffwechsel und die Kohlenstoffverwertungswege . Für die Schwefelatmung enthielten die meisten Abstammungslinien des CCTB das mutmaßliche MbsL-kodierende Gen für die katalytische Untereinheit des MBS- und/oder MBH-Komplex-kodierenden Genclusters (ergänzende Abbildung 9)40, das für den Schwefel- und Wasserstoffstoffwechsel verantwortlich ist. Da die Schwefelatmungsfähigkeit das Wachstum von 3DAC in der vorliegenden Studie und anderen Stämmen in früheren Studien stark stimuliert76, deutet dies darauf hin, dass ihr Vorfahre möglicherweise aus einer hydrothermalen Quelle oder einer heißen Quellenumgebung stammt, die reich an Schwefelverbindungen ist77,78. Für die Kohlenstoffassimilation gelten Mitglieder der Kladen Zhurongbacter, Caldisericota, Coprothermobacterota, Dictyoglomota und Thermotogota als thermophile heterotrophe Bakterien, sie haben jedoch ihre Präferenzen für Kohlenstoffquellen variiert (ergänzende Abbildung 8), wie z. B. Gewinn und Verlust von Genen für Peptid und Zucker Transport- und Motilitätsgene (Abb. 4).

Veranschaulichung der Stoffwechselmerkmale des CCTB-Vorfahren und verschiedener Bakterienlinien des CCTB (Ergänzungsdaten 6). Der hier gezeigte hydrothermale Schlot weist darauf hin, dass diese Bakterien möglicherweise aus ähnlichen Umgebungen auf der frühen Erde stammen, jedoch während ihrer Evolutionsgeschichte Anpassungsstrahlung ausgesetzt waren. Pro-Proteine, Sac. Saccharide, OC organischer Kohlenstoff.

Da sich die Kultivierungstechnologien rasch weiterentwickeln, werden tiefer verzweigte thermophile Bakterien, die mit dem CCTB geclustert werden, isoliert und durch unsere neu entwickelte Kultivierungsstrategie umfassend charakterisiert. Die Entdeckung des vorliegenden neuartigen tiefverzweigten Bakterienstamms 3DAC mit der Fähigkeit, die Energieproduktion aus Archaeen zu nutzen, kann als Teil des thermophilen Evolutionspuzzles angesehen werden. Da in Zukunft noch tiefer verzweigte Abstammungslinien entdeckt werden sollen, wird uns die physiologische und evolutionäre Geschichte des CCTB ermöglichen, den grundlegenden Stoffwechsel und die Nischenerweiterung des frühen Lebens zu durchschauen.

Die ursprüngliche Probe wurde mit dem ferngesteuerten Tiefsee-Forschungsfahrzeug (ROV) Jason II während der R/V Atlantis-Forschungskreuzfahrt AT26-10 (Tauchgang 761) aus einem schwarzen Rauchschornstein an der L-Entlüftung am 9°N-Tiefsee gesammelt. Meeresschlotfeld auf dem East Pacific Rise (9°46,25' N, 104°16,74' W, Wassertiefe 2528 m). Die Temperatur der austretenden Flüssigkeit betrug 231 °C. Weitere Informationen zur Fluidgeochemie und den mikrobiellen Gemeinschaften in den Schornsteinwänden finden Sie in Lit. 34. Teile des Schornsteins wurden sofort nach der Entnahme in sterilen anaeroben Röhren gelagert und der Kopfraum in den Röhren wurde mit reinem Stickstoffgas mit leichtem Überdruck gefüllt, um das Eindringen von Sauerstoff zu verhindern. Anschließend wurden die Proben bis zur Anreicherung im Labor bei 4 °C gelagert.

Die äußere Schicht der schwarzen Schornsteinprobe (0,25 g) wurde zunächst anaerob in einem SME-Medium79 angereichert, das die folgenden Komponenten (L−1) enthielt: NaCl, 20,0 g; MgSO4·7 H2O, 3,5 g; MgCl2·6 H2O, 2,75 g; KCl, 0,325 g; KNO3, 2,0 g; MES, 4,27 g; NaBr, 50,0 mg; H3BO3, 15,0 mg; SrCl2·6 H2O, 7,5 mg; (NH4)2SO4, 10·0 mg; KI, 0,05 mg; Na2WO2·2H2O, 0,1 mg; CaCl2·2H2O, 0,75 g; KH2PO4, 0,5 g; NiCl2·6H2O, 2,0 mg; und Resazurin, 1,0 mg. Der pH-Wert des Mediums wurde mit 1 M NaOH auf 6,0 eingestellt. Nach dem Autoklavieren wurden 1 ml Spurenelementmischung, 1 ml Vitaminmischung, 1 ml Thiaminlösung und 1 ml Vitamin B12-Lösung80 zum Medium (L−1) gegeben. Dann wurden 50-ml-Aliquote des Mediums in 150-ml-Glasserumflaschen aufgeteilt und mit 0,5 g elementarem Schwefel und 0,5 ml Na2S·9H2O (10 %, w/v; pH 7,0) ergänzt, und die Flaschen wurden fest verschlossen mit Wasserstoff/Kohlendioxid (80:20; 101 kPa) unter Druck gesetzt. Die Kulturen wurden bei 50 °C inkubiert. Wir erhielten die ursprüngliche Anreicherung in diesem chemolithotrophen Medium, subkultivierten (1 % Inokulation) die Zellen in diesem Medium für fünf Generationen und übertrugen dann die Anreicherung der fünften Generation (1 % Inokulation) auf ein heterotrophes TRM-Medium81 mit der folgenden Zusammensetzung (L −1): 1 g Hefeextrakt, 4 g Trypton, 23 g NaCl, 5 g MgCl2·6H2O, 0,7 g KCl, 0,5 g (NH4)2SO4, 3,3 g PIPES-Dinatriumsalz, 1 ml NaBr (5 %, w/v), 1 ml SrCl2·6H2O (1 %, w/v), 1 ml KH2PO4 (5 %, w/v), 1 ml K2HPO4 (5 %, w/v) , 1 ml CaCl2·2 H2O (2 %, w/v) und 1 ml Na2WO4 (10 mM). Das Medium wurde auf pH 7,0 eingestellt, autoklaviert, in anaerobe Röhrchen (5 ml) aufgeteilt und mit 0,05 g elementarem Schwefel und 0,05 ml Na2S·9 H2O (10 %, w/v; pH 7,0) sowie dem Kopfraum ergänzt Die Rohre wurden mit reinem Stickstoffgas unter Druck gesetzt. Die heterotrophe Anreicherung wurde bei 45 °C durchgeführt. Kolonien wurden auf festem TRM-Medium (1,5 % Gelrite) unter Verwendung der Rollrohrmethode erhalten, die dreimal wiederholt wurde.

Die Fluoreszenzfärbung mit SYBR Green I (Invitrogen) wurde an Zellen durchgeführt, die nach etablierten Protokollen auf 0,2-μm-GTBP-Membranen aus Polycarbonat (Millipore) filtriert wurden82. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon Eclipse 90i) aufgenommen.

Für die Transmissionselektronenmikroskopie wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 3000 × g geerntet, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in 4 % Formaldehyd fixiert und mit 1 × PBS (pH 7,4) gewaschen. Fixierte Zellen wurden zur Beobachtung mit einem Transmissionselektronenmikroskop (FEI Tecnai G2 Spirit Biotwin) bei einer Beschleunigungsspannung von 120 kV mit 2 % (Gew./Vol.) Phosphorwolframsäure (pH 6,5) negativ gefärbt.

Die Auswirkungen der Temperatur, des pH-Werts und der NaCl-Konzentration auf das Wachstum des Stammes 3DAC wurden in einem anaeroben TRM-Medium mit einem Headspace-Gas bestimmt, das aus reinem Stickstoffgas bei Atmosphärendruck, ergänzt mit 1 % (w/v) elementarem Schwefel, bestand. Um die optimale Wachstumstemperatur zu ermitteln, wurde der Stamm 3DAC bei 25–80 °C in Abständen von 5 °C kultiviert. Die pH- und NaCl-Konzentrationsbereiche für das Wachstum wurden bei 45 °C bestimmt. Der optimale pH-Wert für das Wachstum wurde bestimmt, indem der pH-Wert im Kulturmedium zwischen 4,0 und 9,0 variiert wurde, wobei die folgenden Puffer in einer Konzentration von 10 mM verwendet wurden: Acetat bei pH 4,0, 4,5 und 5,0; MES bei pH 5,5 und 6,0; PIPES bei pH 6,5 und 7,0; HEPES bei pH 7,5 und 8,0; und TAPS bei pH 8,5 und 9,0. Der pH-Wert wurde vor dem Autoklavieren bei Raumtemperatur eingestellt. Um die Auswirkung der NaCl-Konzentration auf das Wachstum zu testen, wurde dem Medium NaCl in Endkonzentrationen im Bereich von 0,5–5,0 % (Gew./Vol.) zugesetzt. Alle diese Tests wurden dreifach im Dunkeln ohne Schütteln durchgeführt. Das Wachstum wurde durch Überwachung der OD600 mit einem Quarzkolorimeter (50 mm optischer Weg) auf einem Spektrophotometer (HACH DR5000) bestimmt. Die spezifische Wachstumsrate (μ; h −1) wurde gemäß der Gleichung μ = ln[OD600(t2)/OD600(t1)]/(t2 − t1) berechnet, wobei OD600(t1) und OD600(t2) sind optische Dichten von Flüssigkulturen, gemessen bei 600 nm zu den Zeitpunkten t2 und t1, und t1 und t2 sind die Zeitpunkte (in Stunden) der exponentiellen Wachstumsphasen83. Die Wachstumsraten wurden mithilfe einer linearen Regressionsanalyse von 4 bis 6 Punkten entlang der linearen Abschnitte der Wachstumskurven berechnet.

Der Druckbereich (0,1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 und 100 MPa) wurde mit Spritzen getestet, die mit TRM (2,5 % NaCl, pH 7,0), ergänzt mit 1 % (w/m) beladen waren. v) elementarer Schwefel. Diese Spritzen wurden in Hochdruck- und Hochtemperaturreaktoren gegeben und bei 70 °C inkubiert. Wachstumserträge und Wachstumsraten wurden wie zuvor beschrieben gemessen. Alle diese Tests wurden dreifach durchgeführt.

Mutterlaugen von 20 Arten von Aminosäuren (L-Alanin, L-Arginin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Cystein, L-Glutamin, L-Glutaminsäure, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L -Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Valin) hergestellt. Dann wurde jede Kombination aus 19 Aminosäure-Mutterlösungen zu TRM-Basismedium (2,5 % NaCl, kein Hefeextrakt oder Trypton, ergänzt mit 1 ml Spurenelementlösung84, 10 ml Vitaminlösung85 und 1 % (Gew./Vol.) Elementarlösung gegeben Schwefel), um jede Aminosäure auf einer Endkonzentration von 0,1 g/L zu halten. Als Positiv- bzw. Negativkontrolle wurde Basal-TRM-Medium verwendet, das alle 20 Aminosäuren und keine Aminosäuren enthielt. Der pH-Wert aller getesteten Medien wurde bei Raumtemperatur auf 7,0 eingestellt. Bei allen Tests wurden positive Kulturen zur Bestätigung des Wachstums mindestens fünfmal in das getestete Medium überführt (1 % Inokulum). Alle Tests wurden doppelt bei Atmosphärendruck und mit Inkubation bei 70 °C durchgeführt.

Verschiedene einzelne Kohlenstoffquellen wurden zu einem TRM-Basismedium (2,5 % NaCl, enthaltend nur 0,002 % Hefeextrakt, ohne andere organische Kohlenstoffquellen), ergänzt mit 1 % (w/v) elementarem Schwefel, hinzugefügt. Die folgenden einzelnen Kohlenstoffquellen wurden getestet, alle mit einer Endkonzentration von 0,2 % (Gew./Vol.): Pepton, Casaminosäuren, Rindfleischextrakt, Hefeextrakt, Trypton, Natriumacetat, Natriumformiat, Natriumcitrat, Natriumpyruvat, Natriumoxalat , D-Fructose, D-(+)-Glucose, D-(+)-Xylose, D-(+)-Maltose, Saccharose, Stärke, Glykogen, N-Acetyl-D-Glucosamin, D-Mannit, L-Alanin , L-Arginin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Cystein, L-Glutamin, L-Glutaminsäure, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L -Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Valin. Das Wachstum wurde nach 24 und 48 Stunden aufgezeichnet. Für jedes Substrat wurden negative (nicht inokuliertes Basis-TRM) und positive (inokuliertes TRM mit Hefeextrakt und Pepton) Kontrollen hergestellt. Für alle Tests wurden positive Kulturen zur Bestätigung des Wachstums in das getestete Medium übertragen (1 % Inokulum).

Um die Kohlenstoffquellennutzung durch Zugabe von 20 Arten von Aminosäuren zu testen, wurden verschiedene Kohlenstoffquellen in einer Endkonzentration von 0,2 % (Gew./Vol.) in ein TRM-Basismedium (2,5 % NaCl, kein Hefeextrakt oder Trypton) gegeben und ergänzt mit 20 Arten von Aminosäuren (jeweils in einer Endkonzentration von 0,1 g/L) und 1 % (w/v) elementarem Schwefel. Die verwendeten Kohlenstoffquellen waren wie folgt: D-(+)-Glucose, D-Fructose, D-(+)-Maltose, Saccharose, Stärke, Natriumacetat, Natriumformiat und Natriumpyruvat. Als Kontrolle wurde Basal-TRM-Medium, ergänzt mit 20 Arten von Aminosäuren und 1 % (Gew./Vol.) elementarem Schwefel, verwendet.

Um die Fähigkeit des Isolats zu untersuchen, in Abwesenheit von elementarem Schwefel zu wachsen, wurden Zellen in TRM-Medium (2,5 % NaCl, Natriumsulfat entfernt) ohne Schwefel kultiviert. Andere Schwefelersatzstoffe wie Natriumsulfat (20 mM), Natriumsulfit (20 mM), Natriumthiosulfat (20 mM), L-Cystein (20 mM) und L-Methionin (20 mM) wurden ebenfalls getestet.

Der pH-Wert aller getesteten Medien wurde bei Raumtemperatur auf 7,0 eingestellt. Alle Tests wurden doppelt bei Atmosphärendruck und mit Inkubation bei 70 °C durchgeführt. In Kulturen, die unlösliche Substrate enthielten, wurde das Wachstum durch mikroskopische Untersuchung überwacht.

Die Sulfidkonzentration wurde mit der Methylenblau-Methode86 unter Verwendung eines Sulfid-Messkits (HACH) auf einem Spektrophotometer (HACH DR5000) gemessen.

Genomische DNA wurde mit einer modifizierten SDS-basierten DNA-Extraktionsmethode87 extrahiert und auf den Sequenzierungsplattformen PacBio RSII SMRT und Illumina HiSeq X Ten (BGI, China) sequenziert. Das Genom wurde von Falcon v0.3.088 und Celera Assembler v8.389 aus den PacBio-Reads (3668 Mbit/s, 2308-fache Abdeckung) zu einem Contig zusammengesetzt. Anschließend wurde das zusammengesetzte Genom mit Illumina HiSeq-Daten (736 Mbit/s, 463-fache Abdeckung) unter Verwendung von GATK v1.6–1390 korrigiert. Proteinkodierende Gene wurden mit Glimmer v3.0291 vorhergesagt und rRNA- und tRNA-Annotationen wurden mit RNAmmer v1.292 bzw. tRNAscan-SE v1.3.193 durchgeführt. Die vorhergesagten Genfunktionen wurden mit Datenbanken wie NCBI-nr (aktualisiert am 10. Oktober 2017), KEGG (BlastKOALA, v2.2, aktualisiert am 15. Mai 2019)94 und eggNOG-Mapper v2.0.1b-2-g816e19095 kommentiert. Die durchschnittlichen Werte der Aminosäureidentität (AAI) wurden mit CompareM v.0.0.23 (https://github.com/dparks1134/CompareM) berechnet.

Für die Schornsteinprobe und die chemoautotrophe Anreicherung wurde die bakterielle V4-Region des 16S-rRNA-Gens durch B515F (5'-XXXXXXXXGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') mit Acht-Nukleotid-Schlüsseltags für jede Probe und B806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') amplifiziert. 96; Der X-Bereich repräsentiert die verschiedenen Schlüssel-Tags für jede Probe. Das PCR-Programm dauerte 3 Minuten bei 95 °C, gefolgt von 35 Zyklen bei 94 °C für 40 Sekunden, 56 °C für 1 Minute und 72 °C für 1 Minute. Der letzte Verlängerungsschritt erfolgte 7 Minuten lang bei 72 °C. Die 50-µL-Amplifikationsmischung enthielt 1 µL von jedem Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 1 µL Template-DNA, 5 µL 10× ExTaq-Puffer, 0,5 µL ExTaq-Polymerase (TaKaRa, Japan), 4 µL 2,5 mM dNTP-Mix und 37,5 µL ddwater. PCR-Produkte wurden mit einem EZNA Gel Extraction Kit (OmegaBio-Tek, USA) gereinigt und auf der MiSeq-Plattform (Illumina, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers sequenziert.

Die Datenanalyse der 16S-rRNA-MiSeq-Sequenzen wurde mit der QIIME-Softwarepipeline Version 1.9.197 und der QIIME-kompatiblen Version der SILVA-132-Datenbank für vorlagenbasiertes Alignment und taxonomische Zuordnung durchgeführt. Zusammengesetzte Lesevorgänge, die die Chimärenprüfung bestanden haben, wurden in de novo operativen taxonomischen Einheiten (OTUs) mit einem Cutoff von 97 % Sequenzähnlichkeit geclustert.

Mit und ohne Schwefel kultivierte Zellen des Stamms 3DAC wurden in der logarithmischen Phase durch Zentrifugation geerntet. Für die Transkriptomanalyse wurden drei Replikate unter jeder Bedingung hergestellt. Die Gesamt-RNA wurde mit einem Total RNA Extractor (TRIzol)-Kit (Sangon Biotech, China) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Zur Vorbereitung der RNA-Sequenzierungsbibliothek wurde genomische DNA mit DNase I und ribosomale RNA (rRNA) mit einem Ribo-off rRNA Depletion Kit (Bakterien) (Vazyme Biotech Co., Ltd, China) entfernt. Eine komplementäre DNA-Bibliothek (cDNA-Bibliothek) wurde mit einem VAHTS™ Stranded mRNA-seq Library Prep Kit (Vazyme Biotech Co., Ltd, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers erstellt. Die Sequenzierung wurde auf der Illumina HiSeq 2500-Plattform (Illumina, USA) bei Sangon Biotech (Shanghai Co., Ltd., China) durchgeführt.

Die Sequenzierungsqualitätskontrollen der von Illumina HiSeq 2500 erzeugten Rohdaten wurden mit FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) bewertet und alle Proben bestanden. Lesevorgänge von geringer Qualität (Q-Wert von <20), mehrdeutige „N“-Nukleotide, Adaptersequenzen und Fragmente von <35 bp wurden mit Trimmomatic98 zur weiteren Analyse aus Rohlesevorgängen entfernt. rRNA wurde mit einem sortmerna99 mit Standardeinstellungen entfernt. Die Lesekartierung der Nicht-rRNA zum Genom von Zhurongbacter thermophilus 3DAC wurde mit Bowtie 2100 durchgeführt und die relevanten Kartierungsinformationen wurden zusammengefasst. Die eindeutig kartierten Lesevorgänge wurden gesammelt und mit dem DESeq2-Paket basierend auf der Poisson-Verteilung analysiert, um die differentiell exprimierten Gene (DEGs) zu identifizieren. Die Schätzung der Genexpressionsniveaus basierte auf den Transkript-pro-Millionen-Werten (TPM)101.

Zur Validierung der RNA-Seq-Daten wurden die Expressionsniveaus von zehn zufällig ausgewählten Genen mithilfe quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) quantifiziert. Nach der Extraktion der RNA wurde die restliche DNA mit einem TURBO DNA-free Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) entfernt, und auf die Reverse Transkription der cDNA-Synthese folgte ein RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, USA). Die für die quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR) verwendeten Primer wurden von Primer-BLAST102 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) entwickelt und sind in Supplementary Data 7. Gene aufgeführt Die Expression wurde in verschiedenen Proben unter Verwendung des 16S-rRNA-Gens als Referenzgen quantifiziert. RT-qPCR wurde auf einem StepOnePlus Real-Time PCR-Gerät (Applied Biosystems, USA) mit PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, USA) unter Verwendung des folgenden Programms durchgeführt: 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° 15 s bei C und 1 min bei 60 °C. Alle qRT-PCR-Analysen wurden mit vier technischen Replikaten durchgeführt. Die RNA-Seq-Faltungsänderungen wurden gegen die qRT-PCR-Faltungsänderungen aufgetragen und die Korrelationskoeffizienten (R2) zwischen diesen beiden Datensätzen berechnet (ergänzende Abbildung 10).

Für den 16S-rRNA-Genbaum wurden die 16S-Gensequenzen mit SINA v1.2.11103 ausgerichtet und das vollständige Alignment wurde mit einem Perl-Skript von Spalten befreit, die 70 % oder mehr Lücken enthielten. Die Maximum-Likelihood-Phylogenie des 16S-rRNA-Genbaums wurde von IQ-TREE104 v2.0.6 mit den Optionen „-MFP -B 1000“ für die Auswahl des am besten passenden Modells und ultraschnellen Bootstrap abgeleitet. Die Referenzsequenzen anderer Bakterien wurden aus der Silva-Datenbank heruntergeladen, Sequenzen, die kleiner als 1400 bp waren, wurden herausgefiltert und OTUs wurden aus den verbleibenden Sequenzen mit einem Cutoff von 97 % ausgewählt. Für den Baum wurden die oben beschriebenen repräsentativen OTU-Sequenzen verwendet.

Für die phylogenomische Analyse auf der Grundlage konservierter Proteine ​​wurden der von Coleman et al.24 verwendete repräsentative Bakteriendatensatz und ausgewählte archaeale Referenzgenome aus den verschiedenen Phyla aus der prokaryotischen Genomdatenbank des NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih) heruntergeladen. Regierung/Versammlung/). Diese Referenzgenome und das 3DAC-Genom aus dieser Studie wurden verwendet, um einen phylogenomischen Baum zu erstellen, der auf einer verketteten Ausrichtung von drei verschiedenen Sätzen von Markergenen basiert (Supplementary Data 8–10)24,45,46. Insbesondere wurde jede der Markerproteinsequenzen aus den Referenzgenomen und dem 3DAC-Genom mit dem MAFFT-Algorithmus v7.313105 mit den Parametern --ep 0 --genafpair --maxiterate 1000 abgeglichen und mit trimAl v1.4.rev2106 mit gefiltert Parameter -automated1. Anschließend wurden alle Markerproteinsequenzen zu einem einzigen Alignment verkettet und phylogenetische Bäume mit IQ-Tree104 v2.0.6 mit dem am besten passenden Modell LG + C60 + R10 mit einem ultraschnellen Bootstrap-Wert von 1000 erstellt.

Um die phylogenetische Zugehörigkeit des Stammes Aquificota zu veranschaulichen, wurden Referenzgenome aus der NCBI-Datenbank heruntergeladen, und für jeden Stamm wurden 5–10 Genome gemäß der NCBI-Taxonomie heruntergeladen. Anschließend wurde jede der 37 Markerproteinsequenzen aus den Referenzgenomen extrahiert und mithilfe des MAFFT-Algorithmus v7.313 mit den Parametern --ep 0 --genafpair --maxiterate 1000 abgeglichen und mit trimAl v1.4.rev2 mit dem Parameter - gefiltert. automatisiert1. Anschließend wurden 37 Markerproteinsequenzen separat verwendet, um mithilfe von IQ-Tree v2.0.6 mit dem Modell LG + C60 + F + G und einem ultraschnellen Bootstrap-Wert von 1000 phylogenetische Bäume zu erstellen, um die potenziellen HGT-Ereignisse zu bewerten.

Für die phylogenetische Analyse des MbsL-Proteins wurden seine Sequenzen aus den Referenzgenomen von Caldisericota, Thermotogota, Thermodesulfobiota, Aquificota, Zhrongbacter und Thermococcales extrahiert. Diese Sequenzen mit Referenzen wurden dann mit dem MAFFT-Algorithmus v7.313 mit den Parametern --ep 0 --genafpair --maxiterate 1000 abgeglichen und mit trimAl v1.4.rev2 mit dem Parameter -automated1 gefiltert. Danach wurde der phylogenetische Baum mit IQ-Tree v2.0.6 und dem am besten passenden Modell mit einem ultraschnellen Bootstrap-Wert von 1000 erstellt. Alle Bäume wurden mit der Online-Software iTOL107 visualisiert.

Für evolutionäre Analysen wurden insgesamt 43 kultivierte vollständige Bakteriengenome (Supplementary Data 11) aus dem CCTB sowie potenzielle Kandidatenphyla ausgewählt. Die Genome wurden aus der NCBI-Genomdatenbank heruntergeladen und mit Prodigal Version 2.6.3108 vorhergesagt. Anschließend wurden alle Genome mit eggNOG-Mapper v2.0.1b-2-g816e19095 annotiert. Die vergleichende Genomanalyse wurde von OrthoFinder109 mit Standardparametern durchgeführt. Insgesamt wurden 6.578 Orthogruppen aus 43 repräsentativen Genomen von OrthoFinder109 erhalten. Die Orthogruppen, die vier oder mehr Sequenzen enthalten, wurden mit dem MAFFT-Algorithmus v7.313105 mit den Parametern --ep 0 --genafpair --maxiterate 1000 separat ausgerichtet, mit trimAl v1.4.rev2106 mit dem Parameter -automated1 gefiltert und dann wurden Bäume erstellt konstruiert mit IQ-Tree mit dem am besten passenden Modell. Um die Evolutionsgeschichte des CCTB zu untersuchen, wurden Gensätze der Ahnenfamilie mithilfe des Programms Amalgamated Likelihood Estimation (ALE) Version 0.4110 abgeleitet. In der vorliegenden Studie wurden nur Bakterien mit vollständigen Genominformationen berücksichtigt, da unvollständige Genome zu verzerrten Analysen der Gengewinn- und -verlustprozesse führen würden. Als Außengruppen wurden hier die Phyla Synergistota und Deinococcota verwendet. Die repräsentativen Genome der Phyla Aquificota, Thermosulfidibacterota und Thermodesulfobacteriota wurden ebenfalls in der ALE-Analyse berücksichtigt. Für die CCTB umfassen kultivierte Bakterien mit vollständigem Genom im Stamm Dictyoglomota Dictyoglomus turgidum DSM6724 und Dictyoglomus thermophilum H-6-12; der Stamm Thermodesulfobiota umfasst Thermodesulfobium acidiphilum 3127-1 GCA und Thermodesulfobium narugense DSM14796; der Stamm Caldisericota umfasst Caldisericum exile AZM16c01; der Stamm Zhurongbacter umfasst Zhurongbacter thermophilus 3DAC; der Stamm Coprothermobacterota umfasst Coprothermobacter platensis DSM11748 und Coprothermobacter proteolyticus DSM5265; und der Stamm Thermotogota umfasst Pseudothermotoga hypogea DSM11164, Thermotoga neapolitana DSM4359, Thermosipho melanesiensis BI429, Fervidobacterium pennivorans DSM9078, Kosmotoga pacifica SLHLJ1, Mesotoga prima MesG1Ag42, Defluviitoga tunisiensis L3, Petrotoga mobilis SJ95, Marinitoga piezophila KA3 und Athalassotoga saccharophila NAS-01. Die metabolische Rekonstruktion der Vorfahren wurde mit dem vorhergesagten Stammgensatz (851 Sequenzen) am Knoten des CCTB mit einer durchschnittlichen Genkopienzahl von mehr als 0,3 durchgeführt.

Ein Stoffwechselmodell von Zhurongbacter thermophilus 3DAC im Genommaßstab, GEM-i3DAC, wurde auf der Grundlage des vollständigen Genoms des 3DAC-Stammes erstellt. Der Entwurf der Modellkonstruktion bezog sich auf die orthologe Zuordnung zu öffentlichen Datenbanken (KEGG111, EggNOG95, BIGG112,113, ModelSeed114 und TCDB115) (durchgeführt im November 2020) und das veröffentlichte Modell des verwandten thermophilen Bakterienstamms Thermotoga maritima MSB8116,117. Nach der Modellrekonstruktion des Entwurfs wurden umfangreiche manuelle Kurationen durchgeführt, um die neuesten biochemischen Beweise für enzymatische Funktionen bei (Hyper-)Thermophilen zu integrieren. Insgesamt wurden 57 Reaktionen im 3DAC-Modell Literaturnachweise zugeordnet. Die Biomassegleichungen von 3DAC wurden auf der Grundlage der Biosynthese von Makromolekülen, einschließlich DNA, RNA und Proteinen, formuliert. Ihre Biosynthese wurde so definiert, dass sie die Millimol-Zusammensetzung jedes Bausteins beim Zusammenbau eines Gramms einer bestimmten Komponente und die damit verbundenen Energiekosten berücksichtigt. Simulationen der Kohlenstoffquellennutzung, der Elektronenakzeptoren und der Gendeletion wurden mit Austauschbeschränkungen formuliert, die die entsprechenden in den Experimenten verwendeten Kulturbedingungen widerspiegeln.

Die KO-Terme des vorhergesagten Ahnengensatzes wurden verwendet, um das anfängliche Stoffwechselmodell im Genommaßstab des letzten gemeinsamen Vorfahren des CCTB zu erstellen. Die Reaktionen für jeden KO-Begriff wurden der neuesten KEGG-Datenbank entnommen (durchgeführt im März 2022). Die Verbindungen wurden zunächst aus der neuesten KEGG-Datenbank eingeführt, es wurden jedoch die physiologischen Ladungen jeder einzelnen Verbindung und die modifizierte Wasserstoffzahl der geladenen Verbindungen hinzugefügt. Die Biomasse-Zielfunktion wurde aus dem Escherichia coli-Kernmodell118 eingeführt, einschließlich DNA, RNA und Proteinen, die etwa 80 % des Trockengewichts der Zellen ausmachten119 (Supplementary Data 2). Stoffwechselsimulationen wurden durchgeführt, wobei Austauschbeschränkungen auf der Grundlage der in typischen Hydrothermalquellen gemessenen Umweltparameter 120 und der potenziellen Nährstoffe und Produkte ermittelt wurden, die durch die Stoffwechselrekonstruktion aufgedeckt wurden (Ergänzungsdaten 2). Das aktuelle Wissen über die Aminosäuresynthesewege in Bakterien und Archaeen auf der Grundlage von Genannotationen ist unzureichend, und Aminosäuren, die im Syntheseweg fehlen oder unvollständig sind, können auch nicht essentiell sein121,122. 3DAC haben sehr ähnliche Stoffwechseleigenschaften wie Thermococcus, und basierend auf unseren früheren Ergebnissen von Tests auf essentielle Aminosäuren für Thermococcus eurythermalis A501 und dem Vorhandensein/Fehlen ihrer Schlüsselenzyme im gesamten Genom123 haben wir ein Kriterium für die Bestimmung essentieller Aminosäuren bei 3DAC festgelegt auf genomischer Ebene und versucht, die durch diese Wissenslücke verursachte Verzerrung zu verringern. Als essentielle Aminosäuren wurden diejenigen identifiziert, denen 50 % oder mehr der Reaktionen im gesamten Biosyntheseweg fehlen. Andere Aminosäuren wurden als nicht essentiell behandelt. Um die Wachstumsausbeuten unter Verwendung der getesteten einzigen Kohlenstoffquellen quantitativ zu simulieren, wurde jede Kohlenstoffquelle auf 10 mM Gesamtkohlenstoff beschränkt, um den Einfluss unterschiedlicher Kohlenstoffzahlen in der Formel mit allen essentiellen Aminosäuren (jeweils 1 mM) zu vermeiden.

Sowohl für das 3DAC-Modell als auch für das Ahnenmodell wurden Konsistenzprüfungen aller Reaktionen rechnerisch unter Verwendung der Formelprüfungs-, Ladungsprüfungs- und Massenprüfungsfunktionen in PSAMM Version 1.1.1 (https://zhanglab.github.io/psamm/)124 durchgeführt Unausgeglichene Gleichungen wurden manuell kuratiert. Lückenfüllprozesse wurden durchgeführt, um die Synthese der wichtigsten Biomassekomponenten (DNA, RNA und Proteine) und essentiellen Cofaktoren (dh NAD+/NADP+ und CoA) durch die Fastgapfill-Funktion in PSAMM abzuschließen. Die Flussvariationsanalyse (FVA) zur Optimierung der Biomasseproduktion wurde mithilfe der FVA-Funktion in PSAMM mit IBM ILOG CPLEX Optimizer Version 12.7.1.0 durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Genomsequenz von Zhurongbacter thermophilus 3DAC wurde rekonstruiert und unter der Hinterlegungsnummer CP046447 hinterlegt. Amplikon-Sequenzierungsdaten wurden bei SRA unter den Zugangsnummern SRR14072822, SRR14072823, SRR14072817, SRR14072825, SRR14072824, SRR14072798 und SRR14072797 hinterlegt, und Transkriptomsequenzdaten wurden bei SRA unter den Zugangsnummern SRR14072 hinterlegt 890 und SRR14072891. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken allen Besatzungsmitgliedern von R/V Atlantis und ROV Jason II während der Kreuzfahrt AT26-10 für ihren Einsatz und ihre Hilfe bei der Probenentnahme. Wir danken Dr. Fengping Wang für ihre nützlichen Diskussionen zum experimentellen Design und zum Schreiben von Artikeln. Wir danken außerdem Dr. Tom A. Williams und Edmund Moody für ihre freundliche Unterstützung und Diskussion der phylogenetischen Analysen. Diese Studie wurde durch folgende Fördermittel finanziell unterstützt: die Natural Science Foundation of China (Fördernummer 41921006, 41776173, 92051116, 91951209, 20ZR1428000, 42106087), das National Key R&D Project of China (Fördernummer 2018YFC0309800) sowie die USA Zuschuss OCE-1136727 der National Science Foundation und des WHOI Investment in Science Fund an SMS

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Hao Leng, Yinzhao Wang.

Staatliches Schlüssellabor für mikrobiellen Stoffwechsel, Fakultät für Biowissenschaften und Biotechnologie, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China

Hao Leng, Yinzhao Wang, Weishu Zhao und Xiang Xiao

Internationales Zentrum für Deep Life Investigation (IC-DLI), Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China

Hao Leng, Yinzhao Wang, Weishu Zhao und Xiang Xiao

Abteilung für Biologie, Woods Hole Oceanographic Institution, Woods Hole, MA, USA

Stefan M. Sievert

Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Zhuhai), Zhuhai, Guangdong, China

Xiang Xiao

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XX hat das Projekt entworfen und überwacht. XX und SMS haben die Schornsteinproben gesammelt. HL führte die Experimente durch. YW führte die phylogenetischen und evolutionären Analysen mit Input von HLWZ durch, kuratierte die Genomanmerkungen und führte die Stoffwechselmodellkonstruktionen und -simulationen durch. YW, HL und WZ analysierten die Daten. YW, HL, WZ und XX haben das Manuskript geschrieben. SMS überarbeitete das Manuskript. Alle Autoren haben zur endgültigen Fassung des Manuskripts beigetragen und das Manuskript und die unterstützenden Informationen genehmigt.

Korrespondenz mit Xiang Xiao.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Leng, H., Wang, Y., Zhao, W. et al. Die Identifizierung einer tief verzweigten thermophilen Gruppe gibt Aufschluss über die frühe Bakterienentwicklung. Nat Commun 14, 4354 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39960-x

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Eingegangen: 25. Oktober 2022

Angenommen: 06. Juli 2023

Veröffentlicht: 19. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39960-x

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