Strukturelle Grundlagen der Peptidoglycan-Synthese durch E. coli RodA

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 5151 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Peptidoglycan (PG) ist ein wesentlicher Strukturbestandteil der bakteriellen Zellwand, der während der Zellteilung und -verlängerung synthetisiert wird. PG bildet ein extrazelluläres Polymer, das für die Lebensfähigkeit der Zellen entscheidend ist und dessen Synthese das Ziel vieler Antibiotika ist. Für den PG-Zusammenbau ist eine Glykosyltransferase (GT) erforderlich, um mithilfe eines Lipid-II-Substrats ein Glykanpolymer zu erzeugen, das dann über eine Transpeptidase (TP)-Reaktion mit dem vorhandenen PG vernetzt wird. Ein Form-, Elongations-, Teilungs- und Sporulations-GT-Enzym (SEDS) und ein Penicillin-Bindungsprotein der Klasse B (PBP) bilden den Kern des Multiproteinkomplexes, der für die PG-Assemblierung erforderlich ist. Hier verwendeten wir Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie, um die Struktur eines zelldehnungsspezifischen E. coli-RodA-PBP2-Komplexes zu bestimmen. Wir kombinieren diese Informationen mit biochemischen, genetischen, spektroskopischen und rechnerischen Analysen, um die Lipid-II-Bindungsstellen zu identifizieren und einen Mechanismus für die Lipid-II-Polymerisation vorzuschlagen. Unsere Daten legen eine Hypothese für die Bewegung des Glykanstrangs von der Lipid-II-Polymerisationsstelle von RodA zur TP-Stelle von PBP2 nahe, wodurch diese beiden zentralen enzymatischen Aktivitäten, die für die Zellwand-Peptidoglycan-Biosynthese erforderlich sind, funktionell verknüpft werden.

Die Zellform in Bakterien wird durch das extrazelluläre Polymer Peptidoglycan (PG) bestimmt und aufrechterhalten, ein netzartiger Sack, der die Zytoplasmamembran umgibt und aus polymerisierten Glykanketten besteht, die durch kurze Peptide vernetzt sind1. Die PG-Synthese ist geschwindigkeitsbestimmend für das Bakterienwachstum und ihre Störung führt zur Zelllyse oder zum Stoppen des Wachstums, was von vielen Naturprodukten und halbsynthetischen Antibiotika ausgenutzt wird2,3,4,5. Dazu gehören β-Lactame, die bisher klinisch erfolgreichsten Antibiotika6,7. Die zytoplasmatischen Proteine, die den PG-Vorläufer Lipid II synthetisieren – ein Undecaprenyl (C55)-Pyrophosphat (Und-PP)-verknüpftes Disaccharid von N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und N-Acetylmuraminsäure (MurNAc)-Pentapeptid – und die dafür verantwortlichen extrazellulären Proteine die anschließende Polymerisation von PG, wurden einzeln biochemisch und strukturell charakterisiert8,9.

Im Periplasma beginnt die PG-Biosynthese mit einer Lipid II-spezifischen Glykosyltransferase (GT), die ein Glykanstrangpolymer bildet, indem sie die Disaccharide zweier Lipid II-Moleküle verknüpft, von denen eines als Donor und das andere als Akzeptor bezeichnet wird, und dadurch Und-PP freisetzt der Spenderstelle (Abb. 1a). Nachdem die beiden anfänglichen Lipid-II-Moleküle miteinander verbunden wurden, wird das resultierende Tetradisaccharid, das an Und-PP gebunden ist und als Lipid IV bezeichnet wird, zum Donor für einen anderen Lipid-II-Akzeptor, der wiederum sein Tetrasaccharid an das Lipid-II-Disaccharid bindet um Lipid VI zu ergeben. Dieser Zyklus wiederholt sich prozessiv und erzeugt zunehmend längere Polysaccharidketten, die an Und-PP gebunden sind (die römische Zahl gibt die Anzahl der Monosaccharidgruppen in der Polysaccharidkette an). Sobald das wachsende Glykanpolymer eine ausreichende Länge erreicht, wird es durch eine Transpeptidase (TP) über Peptidvernetzungen zwischen dem Pentapeptid des Glykanstrangs und einem Peptidstamm am vorhandenen PG-Säckchen an den vorhandenen PG-Säckchen gebunden, um vernetztes PG zu ergeben (Abb. 1a). In E. coli vermitteln das GT RodA aus der SEDS-Familie (Shape, Elongation, Division, and Sporulation) und PBP2, das monofunktionelle TP-Klasse-B-Penicillin-Bindungsprotein, diese jeweiligen enzymatischen Aufgaben10. RodA ist ein integrales Membranprotein, das aus zehn Transmembran(TM)-Helices besteht11, während PBP2 eine einzelne TM-Helix und eine extrazelluläre Domäne mit einer klassischen Klasse-B-PBP-Faltung aufweist, die das aktive TP-Zentrum enthält12,13. Zusammen bilden sie den Kern des Elongasoms14, des Komplexes, der für die Bestimmung der Stäbchenform der Bakterien verantwortlich ist. Trotz jüngster Fortschritte in unserem Verständnis dieser molekularen Maschine15,16, nicht zuletzt aufgrund der Ableitung der Kristallstruktur eines Thermus thermophilus-RodA-PBP2-Komplexes17, bleiben grundlegende mechanistische Fragen ungelöst. Dazu gehört die Charakterisierung molekularer Determinanten und Konformationszustände, die für i) die Lipid-II-Bindung, ii) die GT-Polymerisation von Glykansträngen und iii) die anschließende Translokation des Glykanpolymers zum aktiven TP-Zentrum erforderlich sind.

a Oben schematische Darstellung der durch RodA (grün) und PBP2 (blau) katalysierten Reaktion. Unten ist die chemische Darstellung der Peptidoglycan-Synthese mit Lipid-II-Bausteinen und chemischen Komponenten von Lipid II in einem Kasten oben links dargestellt. b Kryo-EM-Dichtekarte des RodA-PBP2-Komplexes. Die RodA und PBP2 entsprechende Dichte wird in Grün bzw. Blau angezeigt. c Struktur des RodA-PBP2-Komplexes, dargestellt als Band mit RodA in Grün und PBP2 in Blau. Ungefähre Membrangrenzen werden als gepunktete Linien dargestellt. d Schematische Darstellung der regenbogenfarbenen Topologie von RodA vom C-Terminus (blau) bis zum N-Terminus (rot), bestehend aus zehn TM-Helices und einer wohlgeordneten periplasmatischen Region zwischen TM-Helix 7 und 8. e Struktur von RodA um 90° gedreht dargestellt , wobei die zehn TM-Helices wie in e gefärbt sind. Die ungefähren Membrangrenzen sind wiederum als gepunktete Linien dargestellt.

Hier verwendeten wir Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), um die Struktur des E. coli-RodA-PBP2-Komplexes zu bestimmen, ausgedrückt als funktionelle Fusion und rekonstituiert in lipidgefüllten Nanoscheiben, mit einer Auflösung von 3,0 Å. Wir verwendeten einen integrierten Ansatz – die Kombination von Strukturinformationen mit biochemischen und genetischen Tests, Molekulardynamiksimulationen (MD) und ortsgerichteten Spinmarkierungsexperimenten (SDSL) mit doppelter Elektronen-Elektronen-Resonanz (DEER) –, um die molekularen Determinanten der Substratbindung und Katalyse zu untersuchen und Konformationsänderungen, die für das Funktionieren dieser Prozessmaschinerie erforderlich sind. Unsere Studien legen einen Mechanismus nahe, der die Wanderung eines wachsenden Glykanpolymers zur TP-Stelle von PBP2 erleichtern und so eine TP-abhängige Vernetzung zur Bildung der PG-Schicht ermöglichen würde.

Obwohl die meisten Bakterien separate offene Leserahmen (ORFs) enthalten, die die GT- (SEDS) und TP- (PBP) Aktivitäten kodieren, gibt es Beispiele für einen einzelnen ORF, der eine SEDS-PBP-Fusion kodiert18. Wir haben zuvor gezeigt, dass ein synthetisches Konstrukt, das aus einem SEDS-Protein besteht, das mit seinem verwandten PBP fusioniert ist, Gendeletionen beider Enzyme funktionell ergänzt13. Wir kamen zu dem Schluss, dass eine SEDS-PBP-Fusion biochemisch leichter zu handhaben wäre als die einzelnen Komponenten und dass ihre Struktur in einer Lipidumgebung ein mechanistisches Verständnis des Gesamtkomplexes erheblich erleichtern würde. Wir haben 189 SEDS-Orthologe auf Expression und Stabilität in Detergenzien untersucht, um diejenigen zu identifizieren, die für Strukturstudien geeignet sind19. Aus diesem ersten Screening wurden SEDS-Proteine ​​von fünf verschiedenen Spezies mit den höchsten Expressionsniveaus und der höchsten Stabilität ausgewählt, um eine Reihe von Fusionen mit einem oder mehreren speziesangepassten PBPs zu entwerfen, was zu acht einzigartigen Konstrukten führte (Ergänzungstabelle 1). Diese wurden erneut auf Expression und Stabilität im Waschmittel nach Metallaffinitätschromatographie (unter Verwendung eines genetisch kodierten Polyhistidin-Tags) und auf Monodispersität mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) untersucht. Basierend auf diesen Kriterien hatte ein Fusionskonstrukt zwischen E. coli RodA und PBP2 (ergänzende Abbildung 1a) das vielversprechendste Profil für die Strukturbestimmung.

Als nächstes bestätigten wir, dass diese E. coli RodA-PBP2-Fusion GT-Aktivität aufweist – die im Gegensatz zu bifunktionellen PBPs der Klasse A nicht durch Moenomycin gehemmt wird – wie durch Polymerisation von Lipid II beobachtet, das mit einer fluoreszierenden Dansylgruppe modifiziert ist (Dansyl-Lysin-Lipid II). ; Ergänzende Abb. 1b, c, e). Die TP-Domäne bindet (und wird durch dieses kovalent modifiziert) ein fluoreszierendes Penicillin-Mimetikum Bocillin20, ergänzende Abbildung 1d, f), was darauf hindeutet, dass die TP-Domäne intakt ist. Wir haben das RodA-PBP2-Fusionsprotein und als Kontrollen RodA allein (endet am Rest 373 von RodA) und eine Fusion von RodA mit nur der einzelnen TM-Helix von PBP2 (endet am Rest 47 von PBP2) in Detergens gereinigt (ergänzende Abbildung 1g). ). Diese Proteine ​​wurden auf ihre Lipid-II-Polymerisationsaktivität untersucht (ergänzende Abbildung 1h). Isoliertes RodA weist eine restliche GT-Aktivität auf, wird jedoch durch das Vorhandensein der Transmembranhelix von PBP2 sowohl in der Volllängenfusion als auch in der verkürzten Version erheblich stimuliert. Diese Ergebnisse stimmen mit dem überein, was zuvor für die T. thermophilus-Proteine ​​gezeigt wurde17.

Die RodA-PBP2-Fusion wurde durch Metallaffinitätschromatographie und anschließende SEC bis zur Homogenität in Detergens gereinigt und dann zur anschließenden Vitrifizierung und Kryo-EM-Analyse in lipidgefüllte Nanoscheiben rekonstituiert (ergänzende Abbildung 1i-l). Dies führte zu zwei lokal verfeinerten Karten rund um die TM- und periplasmatischen Regionen, beide mit einer Auflösung von 3,0 Å (Abb. 1b, Ergänzungstabelle 2 und Ergänzungstabelle 2). In der TM-Karte konnten wir die RodA-Struktur zuverlässig aufbauen und die Sequenz von den Resten 9 bis 93 und 109 bis 364 sowie die angrenzende PBP2-Einzel-TM-Helix von den Resten 10 bis 40 zuordnen (ergänzende Abbildung 3). Die Struktur zeigt zehn RodA TM -Helices mit intrazellulären N- und C-Termini. Die TM-Helices 1–6 und TM-Helices 8–10 bilden ein dichtes Helixbündel, von dem sich die TM-Helix 7 weg erstreckt und durch drei periplasmatische Juxtamembranhelices (PH1, PH2 und PH3) stabilisiert wird (Abb. 1d, e). Zusätzlich ist die PBP2-Einzel-TM-Helix geordnet und gegen die RodA-TM-Helices 8 und 9 gepackt (Abb. 1c).

Die lösliche PBP2-Domäne ist weniger gut aufgelöst, aber mit Namdinator21 und seiner zuvor veröffentlichten Kristallstruktur als Eingabemodell22 konnten wir die Reste 10–343, 401–430, 457–540 und 569–612 aufbauen. Wir konnten keine interpretierbare Dichte für die Reste 344–400 und 431–456 an der Spitze von PBP2, proximal zum aktiven TP-Zentrum, beobachten (ergänzende Abbildung 4a). Die Bindungsstelle für MreC23 – ein Gerüstprotein, das an PBP2 bindet und vermutlich dessen Aktivität beeinflusst23,24 – auch als Kopfdomäne bekannt, weist die niedrigste lokale Auflösung in der Karte auf (ergänzende Abbildung 4b). Dennoch reichte die Auflösung aus, um die Helices in der Kopfdomäne an die Dichtekarte anzupassen, obwohl wir erhebliche strukturelle Veränderungen im Vergleich zur zuvor veröffentlichten Röntgenkristallstruktur von PBP2 aus E. coli (ergänzende Abbildung 4a) beobachten. .

Beim Vergleich des T. thermophilus-Modells17 mit unserem Modell stellen wir fest, dass die Gesamtstruktur der TM-Region zwischen beiden sehr ähnlich ist, obwohl die Sequenzidentität nur 39% beträgt (ergänzende Abbildung 4c). Dazu gehört die Positionierung der TM-Helix 7, die sich in beiden Fällen ähnlich vom helikalen TM-Kern weg erstreckt. Im Gegensatz dazu beobachten wir in der periplasmatischen Domäne von PBP recht erhebliche strukturelle Unterschiede. Es gibt sowohl eine relative Drehung als auch eine Neigung zwischen den beiden und ein Schließen der Kopf- und Ankerdomäne in unserer Struktur im Gegensatz zu einer Öffnung im T. thermophilus-Modell (ergänzende Abbildung 4c).

Die Synthese des Glykanpolymers erfordert eine Akzeptor- und eine Donor-Bindungsstelle in RodA, die beide zunächst Lipid II aufnehmen. Die beiden anfänglichen Lipid-II-Substrate werden über eine GT-Reaktion verknüpft, wobei der MurNAc-Zucker des Lipid II an der Donorstelle an den GlcNAc des Lipid II an der Akzeptorstelle gekoppelt wird, wobei Und-PP als Produkt an der Donorstelle entsteht (Abb . 1a). Da es sich bei RodA um ein prozessives Enzym handelt, wird Lipid IV (polymerisiertes Lipid II nach der ersten Reaktion) nun zum Donor, sodass das direkt an Und-PP in Lipid IV gebundene MurNAc auf einen eingehenden Lipid II-Akzeptor übertragen werden kann. Damit dies geschieht, muss Lipid IV von der Akzeptor- zur Donorstelle übergehen. Diese Bewegung der wachsenden Glykankette von der Akzeptor- zur Donorstelle ist prozessiv und ermöglicht so die Wiederholung des Zyklus, wodurch zunehmend längere Ketten entstehen (z. B. Lipid VI, Lipid VIII usw.).

Die Analyse des RodA-Teils der Struktur auf mutmaßliche Substratbindungsstellen zeigt zwei Haupthohlräume (als Hohlraum A und B bezeichnet) (Abb. 2a). Hohlraum A liegt zwischen den TM-Helices 6, 7 und 9 und wird auf der einen Seite von PH1 und auf der anderen Seite von den TM-Helices 5 und 6 und der periplasmatischen Schleife (PL3), die die beiden verbindet, umrahmt. Der Rand von Hohlraum A ist mit konservierten Rückständen ausgekleidet (Abb. 2a) und insgesamt polarer Natur (ergänzende Abb. 4d). Es erstreckt sich bis in die Membran, wo es der Lipiddoppelschicht ausgesetzt wird, und ist mit hydrophoben Resten ausgekleidet (Abb. 2a und ergänzende Abb. 4d). Hohlraum B befindet sich auf der gegenüberliegenden Seite von RodA relativ zu Hohlraum A, zwischen den TM-Helices 2, 3, 4 und 10 und ist ebenfalls der Membran ausgesetzt (Abb. 2a). Rückstände, die Hohlraum B auskleiden, sind weniger konserviert, aber in Hohlraum A beobachten wir mehrere positiv geladene Rückstände auf seiner periplasmatischen Seite (Abb. 2a und ergänzende Abb. 4d). Der Bereich, der die beiden Hohlräume verbindet, weist den höchsten Erhaltungsgrad der gesamten Struktur auf (Abb. 2a, b). Aufgrund ihrer Ausrichtung in Bezug auf die TP-Stelle von PBP2 schlagen wir vor, dass die Hohlräume A und B die Donor- bzw. Akzeptorstellen für die beiden Substrate sind24.

eine Hohlraumanalyse der RodA-PBP2-Struktur, wobei RodA-PBP2 als durch Konservierung gefärbte Oberfläche auf einer Skala von grün (keine Konservierung) bis violett (absolute Konservierung) dargestellt ist. Die Hohlräume werden als halbtransparente Fläche in Orange dargestellt. Die Volumina wurden mit dem Voss Volume Voxelator (3 V)-Server52 unter Verwendung von Sonden mit 10- und 2-Å-Radien berechnet, die der äußeren bzw. inneren Sonde entsprechen. b Struktur der Transmembranregion von RodA-PBP2, dargestellt als Band mit interessierenden Resten, dargestellt als Stäbchen, und den Hohlräumen, dargestellt wie in a. Ausschnitte aus Weblogo-Diagrammen58, wie in der ergänzenden Abbildung 6, dargestellt für interessierende Regionen. c Dichtediagramm von Lipid II aus 50 Wiederholungen von 10 μs in unvoreingenommenen CG-MD-Simulationen des RodA-PBP2-Komplexes. Das Diagramm zeigt zwei bevorzugte Bindungsstellen von Lipid II, die mit Hohlraum A und Hohlraum B überlappen. d Vergleich der (linken) Lipid-ähnlichen Dichte, die in Hohlraum A in der Kryo-EM-Karte beobachtet wurde (nur der Bereich der Karte, der dem Lipid-ähnlichen entspricht). Die Dichte wird angezeigt) mit (rechts) der durchschnittlichen Dichte von Und-PP aus einer unvoreingenommenen atomistischen MD-Simulation von RodA-PBP2 mit Und-PP, das ursprünglich in Hohlraum A angedockt war. e Funktionsanalyse der RodA-PBP2 GT-Aktivität unter Verwendung eines in vitro Lipid-II-Polymerisationstests, wobei Die Wirkung verschiedener Rückstände wurde durch Einführung von Punktmutationen und Aktivitätstests untersucht. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um diese Hypothese zu überprüfen, führten wir 50 Wiederholungen von 10 μs unvoreingenommenen grobkörnigen (CG) MD-Simulationen durch, um den Ort und die Wechselwirkungen der beiden Lipid-II-Substrate mit der Oberfläche von RodA zu identifizieren. Die Analyse dieser Simulationen identifizierte zwei bevorzugte Bindungsstellen für Lipid II, die direkt auf die Hohlräume A und B abgebildet sind (Abb. 2c). Von den beiden Bindungsstellen scheint Hohlraum B über die gesamte Simulationszeit hinweg eine höhere Partikeldichte für Lipid II aufzuweisen als Hohlraum A. Dies steht im Einklang damit, dass Hohlraum B die Akzeptorstelle ist und kontinuierlich Lipid II aus der Membran rekrutiert. Die Dichteanalyse ergab auch weitere Wechselwirkungsstellen, aber bei der Auswertung mit PyLipID25 wies Hohlraum B, gefolgt von Hohlraum A, während der Simulationen die höchste Besetzung durch Lipid II auf (ergänzende Abbildung 5a–d). Insbesondere zeigten Arg48 und Arg109 (Hohlraum B) und Arg210 (Hohlraum A) in den CG-Simulationen die höchste Belegung von Wechselwirkungen mit Lipid II (ergänzende Abbildung 5b). In allen Fällen fanden die vorherrschenden Protein-Lipid-II-Wechselwirkungen mit der Peptidoglycan-Pyrophosphat-Kopfgruppe statt, während der Lipidschwanz sowohl mit dem Protein als auch mit der umgebenden Lipidmembran interagierte. Wir haben diese Daten mit dem Andocken von Liganden kombiniert, um unser Modell für die Bindung von Lipid II an die beiden Hohlräume A und B zu verfeinern (ergänzende Abbildung 5e-f).

In Übereinstimmung mit unseren Simulationen beobachteten wir eine verlängerte Dichte in der Kryo-EM-Karte im Hohlraum A (Abb. 2d). Die Form der Dichte stimmt mit Und-PP überein, einem obligatorischen Produkt jeder GT-Reaktion (Abb. 1a). Um diese Beobachtung weiter zu vertiefen, führten wir drei Wiederholungen von 1 μs atomistischen MD-Simulationen von RodA-PBP2 durch, das in eine Phospholipidmembran eingeführt wurde, wobei Und-PP in Hohlraum A angedockt war (ergänzende Abbildung 5g). Während dieser Experimente beobachteten wir, dass Und-PP eng mit diesem Hohlraum verbunden blieb und dass seine durchschnittliche Belegung mit der in den Kryo-EM-Daten vorhandenen Dichte überlappte (Abb. 2d).

Beide Hohlräume weisen positiv geladene Reste auf ihrer periplasmatischen Seite auf (Arg210 in Hohlraum A; Arg48 und Arg109 in Hohlraum B) (Abb. 2b und ergänzende Abb. 6). Unsere Simulationen legen nahe, dass diese Reste mit der Pyrophosphatgruppe von Lipid II interagieren. Ein Äquivalent von Arg210 auf PH1 scheint Teil eines gemeinsamen Strukturelements für GT-C-Glycosyltransferasen zu sein, die Und-PP als Träger verwenden, wie beispielsweise die O-Antigen-Ligase WaaL26,27. Um zu testen, ob Arg210 für die Funktion essentiell ist, mutierten wir es zu Alanin und stellten fest, dass die GT-Aktivität in vitro signifikant verringert war (Abb. 2e und ergänzende Abb. 7a). Wir untersuchten auch den Phänotyp einer Mutation im entsprechenden Arginin in B. subtilis mithilfe eines In-vivo-Sporulationstests13. Hier hängt die Hitzebeständigkeit der Sporen von der Funktion des RodA-Homologs SpoVE (ergänzende Abbildung 8) ab, das Sporen-PG synthetisiert. Wir beobachteten, dass die Mutation von SpoVE Arg212 (entsprechend E. coli RodA Arg210) zu Alanin einen schwerwiegenden Einfluss auf die Sporulation hatte (Ergänzungstabelle 3). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem Bedarf dieses Arginins für die GT-Aktivität (Abb. 2e). Arg48 und Arg109 zeigen beide in Richtung Hohlraum B (Abb. 2b). Die GT-Aktivität ist in vitro und in vivo stark verringert, wenn Arg48 zu Alanin mutiert ist (Abb. 2e, ergänzende Abb. 7a und Tabelle 3), wohingegen sie in vitro bei einem Arg109Ala-Mutanten nur mäßig beeinträchtigt ist. Diese Ergebnisse stimmen mit einer wichtigen Rolle von Arg48 und in geringerem Maße von Arg109 bei der Koordination des Pyrophosphats von Lipid II innerhalb oder in Hohlraum B überein.

Die periplasmatische Schleife aus zwanzig Aminosäuren, die die TM-Helices 3 und 4 (PL2) verbindet, befindet sich neben Hohlraum B und könnte möglicherweise von einem Hohlraum zum anderen reichen und mit den Substraten in beiden Hohlräumen interagieren und/oder eine Rolle bei deren Übergang spielen vom Akzeptor zu den Spenderstellen. Diese Schleife ist von Natur aus flexibel, wie in unseren MD-Simulationen beobachtet (ergänzende Abbildung 5b), und wir konnten die Sequenz nur teilweise der Dichte in diesem Bereich der Kryo-EM-Karte zuordnen. PL2 weist mehrere hochkonservierte Reste auf, darunter Trp102 und Gln111, die in allen analysierten Spezies invariant sind (ergänzende Abbildung 6). PL2 enthält außerdem zwei positiv geladene Reste, Lys97 und Arg101, die zwar nur mäßig konserviert sind, aber für die Interaktion mit Lipid II geeignet positioniert sind. Um die Funktion von PL2 zu untersuchen, haben wir diese beiden geladenen Reste zu Alanin mutiert. Nur Arg101, das stärker konservierte der beiden, zeigte im Vergleich zum Wildtyp eine signifikante Verringerung der Aktivität (Abb. 2e und ergänzende Abb. 7a). Als nächstes mutierten wir Trp102 oder Gln111 zu Alanin und zeigten, dass beide Mutanten eine verringerte GT-Aktivität aufwiesen (Abb. 2e und ergänzende Abb. 7a). Allerdings schien die GT-Aktivität von Trp102 bei einer Mutation zu Phenylalanin erhalten zu bleiben. Die Mutation des äquivalenten Trp104 in B. subtilis SpoVE zu Alanin oder Phenylalanin beeinträchtigte den Sporulationsphänotyp stark (Ergänzungstabelle 3), was mit der funktionellen Bedeutung dieses Rests übereinstimmt.

Schließlich untersuchten wir die mögliche Rolle anderer hochkonservierter Reste, die sich in oder zwischen den beiden Hohlräumen (Glu114, Lys117, Asp159 und Ser344) befinden (Abb. 2b). Die GT-Aktivität in unserem In-vitro-GT-Assay wurde nicht beeinträchtigt, wenn Ser344 zu Alanin mutiert wurde, wohingegen wir eine Verringerung der Aktivität beobachteten, als Asp159 zu Valin mutiert wurde, was mit der schwerwiegenden Wirkung einer Mutation von B. subtilis SpoVE Asp163 (dem Äquivalent von E . coli Asp159) zu Valin in unserem In-vivo-Sporulationstest (Ergänzungstabelle 3). Während Mutationen von Glu114 zu Alanin und Lys117 zu Asparagin nur einen mäßigen Einfluss auf die GT-Aktivität in vitro hatten (Abb. 2e und ergänzende Abb. 7a), waren identische Mutationen der entsprechenden Reste in B. subtilis SpoVE (Glu116Ala, Lys119Asn) schwerwiegend beeinflusste die Sporulationseffizienz (Ergänzungstabelle 3). Die beobachteten Unterschiede zwischen den In-vivo- und In-vitro-Tests lassen darauf schließen, dass selbst eine geringfügig verringerte In-vitro-Aktivität möglicherweise nicht ausreicht, um die In-vivo-Funktion aufrechtzuerhalten, und unterstreichen die Bedeutung der Charakterisierung mutierter Phänotypen in vivo.

Damit sich der Glykanstrang bilden und zum TP-aktiven Zentrum von PBP2 ausdehnen kann, müssen die wachsenden Und-PP-verknüpften Glykane (Lipid II, IV, VI usw.) von der Akzeptorstelle (Hohlraum B) zum Donor übergehen Stelle (Hohlraum A) Stelle bei jeder Katalyserunde28. Damit dies geschieht, muss eine Konformationsänderung in RodA stattfinden, um einen Durchgang zwischen den TM-Helices 1-2 und 8-10 auf der einen Seite und dem helikalen Bündel der TM-Helices 3-7 auf der anderen Seite zu öffnen (Abb. 3a). Die Kryo-EM-Dichtekarte zeigt, dass das Bündel aus den TM-Helices 3–7 insgesamt eine geringere Auflösung aufweist als der Rest des Proteins, was auf ein gewisses Maß an Flexibilität innerhalb dieser Region schließen lässt (Abb. 3b).

a RodA, dargestellt als nach Domänen gefärbtes Band mit TM-Helices 3–7 rot und TM-Helices 1–2 und TM-Helices 8–10 blau. b Lokale Auflösung der Transmembranregion des RodA-PBP2-Komplexes aus der endgültigen Verfeinerung der lokalen Auflösung mit einer Maske um den Transmembranteil des Komplexes. Es ist offensichtlich, dass die Domäne bestehend aus den TM-Helices 3–7 insgesamt eine geringere lokale Auflösung aufweist. c Sterisch erlaubte Rotamere von Nitroxid-Spinmarkierungen (R1) sind für Gly44R1/Asp90R1 auf der Kryo-EM-Struktur dargestellt (orangefarbene Seitenketten). d Die resultierenden DEER-Abstandsverteilungen (durchgezogene schwarze Linie) werden mit vorhergesagten Abstandsverteilungen (Balken) verglichen, die auf den in den Strukturen gezeigten sterisch zulässigen Rotameren (als Seitenketten gefärbt) basieren.

Wir haben die SDSL-DEER-Spektroskopie verwendet, um diese Hypothese weiter zu untersuchen. Die resultierende DEER-abgeleitete Wahrscheinlichkeitsverteilung der Abstände zwischen zwei an bestimmten Stellen eingeführten Nitroxid-Spinmarkierungen (MTSL; R1) liefert Informationen über die Anzahl und Population der Konformationszustände sowie eine Abstandsbeschränkung für jeden einzelnen. Wir ersetzten die beiden nativen Cysteine ​​in RodA durch Mutagenese zu Glycin und Alanin (Cys82Gly und Cys133Ala) und bestätigten, dass der cysteinfreie RodA-PBP2-Fusionskomplex exprimiert und funktionsfähig war (ergänzende Abbildung 9a, b). Anschließend führten wir ein Spin-Label-Paar – Gly44R1 am periplasmatischen Ende von TM-Helix 2 und Asp90R1 am periplasmatischen Ende von TM-Helix 3 – in die RodA-Fusion mit dem cysteinfreien Hintergrund ein (Abb. 3c und ergänzende Abb. 9a-c). . Aus der resultierenden DEER-abgeleiteten Abstandsverteilung wurden drei Populationen mit dominanten Abständen bei 26 Å, 35 Å und 45 Å beobachtet (Abb. 3d und ergänzende Abb. 9d, e). Die vorhergesagten Abstände, die durch Hinzufügen sterisch erlaubter MTSL-Rotamere zur Kryo-EM-Struktur in silico berechnet wurden, ergaben eine Abstandsverteilung zwischen 34 und 48 Å (Abb. 3d), was am besten mit der Population mit dem längsten experimentellen Abstand übereinstimmte. Seitenkettenrotamere, die bis zu +/- 8 Å beitragen können (und in der In-silico-Modellierung berücksichtigt werden), können möglicherweise teilweise die Population im mittleren Abstand (zentriert bei 35 Å) erklären. Allerdings ist eine Konformationsänderung des Rückgrats gegenüber der Kryo-EM-Struktur erforderlich, um den Großteil der Abstände zwischen 20 und 35 Å abzutasten, was bedeutet, dass mehrere Konformationen des helikalen Bündels vorliegen. Diese Populationen haben kürzere Abstände zwischen Gly44R1 und Asp90R1 als in der Kryo-EM-Karte beobachtet, sodass weitere Untersuchungen erforderlich sind, um die Struktur und physiologische Relevanz dieser Zustände zu bestimmen.

In der hochkonservierten Region zwischen den beiden Hohlräumen und zentral in der periplasmatischen Schleife 4 (PL4) befindet sich Asp262, das zuvor als katalytischer Rest identifiziert wurde (Abb. 4a). Um das aktive Zentrum weiter zu definieren, führten wir eine systematische Mutagenese der Asp262 umgebenden Reste durch und testeten deren Auswirkung auf die Funktion mithilfe unseres biochemischen Tests. In Übereinstimmung mit einem früheren Bericht10 macht die Mutation von Asp262 zu Alanin RodA-PBP2 enzymatisch inaktiv (Abb. 4b und ergänzende Abb. 7a). Die Mutationen Glu258Ala, His260Ala oder Thr261Ser hatten trotz des hohen Grades an Konservierung und räumlicher Nähe dieser Reste zu Asp262 keinen Einfluss auf die Aktivität, während die Mutation von Pro257 – ebenfalls proximal zu Asp262 – zu Alanin zum vollständigen Verlust der GT-Aktivität führte (Abb. 4b, Ergänzende Abb. 6 und 7a). Ein ähnlich schwerwiegender Phänotyp wird beobachtet, wenn das Äquivalent von Asp262 in unserem In-vivo-B. subtilis-Assay (Asp263Ala) mutiert wird, zusammen mit einer geringfügigeren Aktivitätsreduzierung für das Äquivalent von Glu258 (Glu259Ala) (Ergänzungstabelle 3).

ein aktives RodA-Zentrum, wobei RodA als grünes Band und PBP2 als blaues Band dargestellt sind und die interessierenden Reste als Stäbchen dargestellt sind. Ausschnitt aus dem Weblogo-Plot, wie in der ergänzenden Abbildung 6, für interessierende Reste dargestellt, Reste werden als Stäbchen dargestellt. Die Kryo-EM-Dichte in Hohlraum A entspricht vermutlich Und-PP, dargestellt als gelbe Oberfläche. b Funktionelle Analyse der RodA-PBP2-GT-Aktivität mithilfe eines In-vitro-Lipid-II-Polymerisationstests zur Überwachung der Wirkung verschiedener Mutationen auf ausgewählte Reste. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. c Schematische Darstellung des mechanistischen Modells für die GT-Reaktion zwischen zwei Lipid-II-Molekülen durch RodA, gesehen von der periplasmatischen Seite der Membran. Das aktive Zentrum Asp262 ist grün hervorgehoben.

Basierend auf unseren modellierten und simulierten Koordinaten von Lipid II, das an beide Hohlräume gebunden ist (ergänzende Abbildung 5a), schlagen wir einen Mechanismus vor, bei dem Asp262 eine zentrale Rolle bei der Durchführung der GT-Reaktion spielt (Abb. 4c), analog zu His338 in WaaL26. In unserem Schema abstrahiert Asp262 ein Proton vom 4'-Hydroxyl von Lipid II in Hohlraum B. Diese Abstraktion des Protons würde es dem 4'-Sauerstoff dann ermöglichen, einen nukleophilen Angriff auf den 1'-Kohlenstoff von MurNAc von Lipid II in Hohlraum A durchzuführen Dadurch wird die Bindung zwischen dem Kohlenstoff und dem Sauerstoff des Phosphats aufgebrochen, was zu einem Und-PP-Produkt in Hohlraum A und Lipid IV (oder Lipid VI, Lipid VII usw.) in Hohlraum B führt. Unsere MD-Simulationen legen nahe, dass sich Arg210 in Hohlraum A befindet und Arg48 in Hohlraum B sowie die Argininreste in PL2 (97–111) (Arg101 und Arg109) greifen in die Pyrophosphat-Kopfgruppen von Lipid II ein, um das Substrat innerhalb des aktiven Zentrums zu koordinieren. Wir testeten, ob die Reaktion metallabhängig ist, beobachteten jedoch keine Änderung der Aktivität durch Zugabe des zweiwertigen Ionen-Chelators EDTA während des Tests, was darauf hindeutet, dass die durch die E. coli-RodA-PBP2-Fusion katalysierte GT-Reaktion metallunabhängig ist (ergänzende Abbildung). 7b). Dies steht im Gegensatz zur GT51-Enzymfamilie, zu der PBPs der Klasse A gehören30,31,32.

Wir haben die Machbarkeit des vorgeschlagenen Mechanismus untersucht, indem wir semiempirische Density Functional Tight Binding (DFTB)33-Berechnungen an einem Clustermodell des mutmaßlichen aktiven RodA-Zentrums durchgeführt haben (ergänzende Abbildung 5a). Anhand dieser Berechnungen haben wir beobachtet, dass die Asp262-aktivierte Bildung von Lipid IV aus zwei in den Hohlräumen A und B gebundenen Lipid II-Substraten angesichts der geometrischen Einschränkungen der RodA-Struktur, die durch unsere atomistischen Simulationen ermittelt wurden, plausibel ist. Mithilfe teilweise konvergenter Nudged-Elastic-Band-Berechnungen stellen wir die Reaktion im Zusatzfilm 1 visuell dar. Dies bestätigt zwar nicht die energetische Machbarkeit des vorgeschlagenen Mechanismus, zeigt aber, dass die Koordination der gebundenen Substrate innerhalb des aktiven Zentrums geometrisch geeignet ist um die Reaktion zu ermöglichen.

Der prozessive Mechanismus von RodA beinhaltet den Transport von Substraten von der Akzeptor- zur Donorstelle, um den wachsenden Glykanstrang schrittweise zu verlängern, bis der führende Pentapeptidstamm die TP-Stelle von PBP234,35 erreicht. Unsere Struktur enthält eine Furche, die sich von der extrazellulären Oberfläche der RodA GT-Stelle bis zur aktiven PBP2 TP-Stelle erstreckt (siehe unten). Das Andocken von Liganden und die Modellierung unterschiedlicher Längen des Glykanstrangs zeigen, dass das an Hohlraum A gebundene Lipid XX (dh zehn Disaccharide) ausreichend lang ist, um das aktive TP-Zentrum zu erreichen und den Peptidstamm mit dem bereits vorhandenen PG zu verbinden. Wir haben RodA-PBP2 modelliert, das nacheinander an Lipid II, Lipid IV bis hin zu Lipid XXII gebunden ist, und MD-Simulationen zeigen, dass die Polysaccharide innerhalb dieser Furche stabil koordiniert sind (ergänzende Abbildung 10a). Der Pentapeptidstamm scheint mobiler zu sein, wenn er nicht an die TP-Stelle gebunden ist, und die Positionen der Polyprenylschwänze in und um die beiden Hohlräume A und B verankern das entstehende PG durch Wechselwirkungen sowohl innerhalb des Proteins als auch mit der Phospholipidmembran an der Membran (ergänzende Abb . 10 A). Der periplasmatische Teil des Komplexes weist einen viel höheren RMSF auf als die TM-Domäne, jedoch ist die Sekundärstruktur von RodA-PBP2 während der Simulationen stabil (ergänzende Abbildungen 5b und 10b).

Bei der Analyse der Kryo-EM-Daten beobachteten wir eine erhebliche strukturelle Heterogenität zwischen RodA und PBP2 (Abb. 5a und ergänzende Abb. 9n). Um dies weiter zu untersuchen, führten wir eine 3D-Variabilitätsanalyse mit einer Maske um PBP2 durch, das die niedrigste lokale Auflösung aufweist und das mobilste der beiden Proteine ​​zu sein scheint (Abb. 5a und ergänzende Abb. 9n). Nach der Aufteilung der Partikel in 6 Cluster beobachten wir eine vertikale Neigung von PBP2 um ~10° in Bezug auf die Doppelschicht sowie eine Drehung um PBP2 (Abb. 5a und ergänzende Abb. 9n). Um diese Beobachtung zu ergänzen, führten wir MD-Simulationen von RodA-PBP2 durch. In Übereinstimmung mit den Kryo-EM-Daten scheint die Spitze von PBP2, die das aktive TP-Zentrum beherbergt, in diesen Simulationen hochdynamisch zu sein (Abb. 5c). Bei den Simulationen mit eingeschlossenen Glykanketten, insbesondere bei solchen mit längeren, beobachten wir eine große Konformationsänderung im extrazellulären Teil von PBP2, die nach oben schwingt, wobei die Spitze von PBP2 von der Membran weg zeigt (ergänzende Abbildung 10c). Wir beobachten in unseren Kryo-EM-Daten keine erweiterte Konformation wie diese, aber wie oben erläutert, beobachten wir Heterogenität in der Probe und verwerfen zahlreiche Partikel, die möglicherweise vorübergehendere Konformationen von PBP2 annehmen.

a Die beiden extremen Konformationen von PBP2 aus der Kryo-EM-3D-Variabilitätsanalyse. b RodA-PBP2 dargestellt als durch RMSF über 3 MD-Simulationen von 1 μs gefärbtes Band, ausgerichtet auf das RodA-Grundgerüst, wobei das Band mit zunehmendem RMSF dicker wird. c Sterisch erlaubte Rotamere von Nitroxid-Spinmarkierungen (R1) sind für Gly44R1/Gln99R1 auf der Kryo-EM-Struktur (links; orangefarbene Seitenketten) und einer Struktur aus einer MD-Simulation (rechts; gelbe Seitenketten) dargestellt. d Die resultierenden DEER-Abstandsverteilungen (durchgezogene schwarze Linie) werden mit vorhergesagten Abstandsverteilungen (Balken) verglichen, die auf den in den Strukturen gezeigten sterisch zulässigen Rotameren (als Seitenketten gefärbt) basieren.

Um dies weiter zu untersuchen, untersuchten wir die Dynamik zwischen PBP2 und RodA mit DEER unter Verwendung eines manipulierten Cysteinpaares zwischen dem Rest Gly44 auf der periplasmatischen Seite der TM-Helix 2 in RodA und dem Rest Gln99 in der Kopfdomäne von PBP2 (Rest 476 in der Fusion) ( Abb. 5b). PBP2 Gln99 befindet sich in der vorgeschlagenen MreC-Bindungsstelle 15, 23, 24, der Region, in der wir die größte Variabilität in den Kryo-EM-Daten beobachten (ergänzende Abbildung 9n). Dieses Paar (Gly44Cys, Gln99Cys) wurde mit Cystein-reaktivem Nitroxid-Spin-Label (R1; MTSL) markiert, seine Funktionsfähigkeit bestätigt (ergänzende Abbildung 9n) und DEER-Daten wurden gesammelt. Die resultierenden DEER-Daten für Gly44R1 und Gln99R1 zeigen eine breite Abstandsverteilung im Bereich von 30 bis 65 Å (Abb. 5d und ergänzende Abb. 9f-h). Der Rest Gly44 in RodA befindet sich in einem relativ statischen Bereich der Struktur (ergänzende Abbildung 5b), sodass die meisten Bewegungen, die zu den DEER-Abständen beitragen, wahrscheinlich auf die Dynamik der MreC-bindenden Kopfdomäne von PBP2 und/oder möglicherweise auf die dynamische Natur zurückzuführen sind der gesamten löslichen Domäne von PBP2 in Bezug auf RodA. Sterisch zulässige MTSL-Rotamere, die in silico an Reste der Kryo-EM-Struktur gebunden sind (Abb. 5b), führen zu einer berechneten Abstandsverteilung im Bereich von 18 bis 40 Å, erfassen jedoch nicht die längeren Abstände der breiten DEER-Verteilung (Abb. 5d). Wenn MTSL-Rotamere außerdem rechnerisch an eine Struktur aus MD (50-ns-Rahmen aus ergänzender Abbildung 10c) angehängt wurden, die eine erweiterte Konformation der Kopfdomäne von PBP2 aufweist, lag die resultierende Abstandsverteilung zwischen 46 und 70 Å (Abb. 5d). . Im Vergleich dazu ergibt ein DEER-Paar innerhalb der PBP2-Domäne (Lys185R1 und Ser330R1) eine einzelne, engere DEER-Abstandsverteilung (ergänzende Abbildung 9i-m). Diese Daten stützen die Annahme, dass die beobachtete Flexibilität zwischen den RodA- und PBP2-Domänen wahrscheinlich auf die Bewegung der Kopfdomäne in Bezug auf RodA zurückzuführen ist. Insgesamt legen diese Daten nahe, dass die DEER-Abstandsverteilung nicht allein durch Seitenkettenkonformere oder kleine Rückgratunterschiede zur Kryo-EM-Struktur erklärt werden kann und erhebliche Rückgrat- oder Domänenkonformationsänderungen darstellen muss, wie in den MD-Simulationen beobachtet.

GT RodA und TP PBP2 bilden den Kern des E. coli-Elongasoms, des Multiproteinkomplexes, der die Bildung der essentiellen PG-Schicht katalysiert. In Kombination liefern unsere Ergebnisse datengestützte Hypothesen für die Architektur, Katalyse und strukturellen Umlagerungen, die für die Peptidoglycan-Synthese erforderlich sind. Die Kryo-EM-Struktur identifizierte zwei Haupthohlräume (A und B) auf der periplasmatischen Seite, die durch eine grobkörnige MD-Analyse als zwei Lipid-II-Bindungsstellen bestätigt werden, wobei Hohlraum A und B als Donor- bzw. Akzeptorstelle dienen. In unserer Kryo-EM-Karte gibt es innerhalb der mutmaßlichen Donorstelle eine lipidähnliche Dichte, die wir vorläufig Und-PP zuordneten, einem Produkt der GT-Reaktion. MD-Simulationen zeigen, dass Und-PP beide Hohlräume stabil besetzen kann und dass seine durchschnittliche Belegung gut mit der beobachteten experimentellen Dichte überlappt.

Durch die Kombination von In-vitro- und In-vivo-Funktionstests, die die GT-Aktivität auf gereinigtem Protein bzw. die Sporulationseffizienz in B. subtilis messen, haben wir begonnen, die Rolle einiger der am stärksten konservierten und/oder geladenen Reste in Hohlraum A und B zu charakterisieren. Die strukturelle Homologie zwischen RodA und anderen Glykosyltransferasen vom GT-C-Typ, die Und-PP-gekoppelte Liganden verwenden26, legt nahe, dass die positiv geladenen Reste an der Koordination des Pyrophosphats beteiligt sein könnten, um entweder dessen Rekrutierung an den Bindungsstellen zu erleichtern oder das Substrat für die Katalyse zu positionieren geschehen. Einige, wie Arg210, scheinen für die Funktion essentiell zu sein, andere weniger, was möglicherweise auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass die Substrataffinität und -spezifität durch mehrere Interaktionsstellen mit dem Protein bestimmt wird. Von Interesse ist die Konservierung und funktionelle Bedeutung eines Tryptophans an Position 102 in PL2 in RodA, das möglicherweise eine ähnliche Rolle wie Trp383 in der bakteriellen Cellulosesynthase BscA36 spielt. Es wurde angenommen, dass dieser Tryptophanrest in BscA als Teil einer „Fingerhelix“ fungiert, die mit den Zuckern des Zellulosesubstrats interagiert und dem wachsenden Glykanstrangpolymer nach seiner Bildung einen Weg aus dem aktiven Zentrum ermöglicht, was charakteristisch für eine prozessive GT ist Enzym37,38. Trp102 in E. coli RodA könnte eine analoge Rolle im prozessiven Lipid-II-Polymerisationsmechanismus spielen. Zwischen den beiden Hohlräumen und als Überbrückung finden wir auch den Rest des aktiven Zentrums Asp262 und mehrere konservierte Reste, die das aktive Zentrum abgrenzen. Wir haben die funktionelle Relevanz dieser Reste sowohl in vitro als auch in vivo untersucht und außerdem gezeigt, dass die GT-Reaktion metallunabhängig ist. Durch die Kombination dieser Ergebnisse mit semiempirischen DFT-Berechnungen für das mutmaßliche aktive RodA-Zentrum schlagen wir einen Mechanismus vor, wie RodA die Reaktion zwischen den beiden Und-PP-verknüpften Glykanen katalysiert (Abb. 6).

Modellierung der verschiedenen Schritte, die bei der Verlängerung des Glykanstrangs ablaufen. Von links beginnend ist RodA-PBP2 im Komplex mit zwei Lipid-II-Molekülen dargestellt. Sobald diese beiden Moleküle durch die GT-Aktivität von RodA verbunden sind, wird Und-PP aus Hohlraum A entweder zwischen TM-Helix 7 und dem Kern von RodA oder unter den JM-Helices in die Membran freigesetzt. Wir haben RodA-PBP2 modelliert, das nacheinander an Lipid II, Lipid IV bis hin zu Lipid XXII gebunden ist, und hier zeigen wir verschiedene Komplexe während der Verlängerung, bis die Glykankette das aktive Zentrum von PBP2 erreicht. RodA-PBP2 wird als Oberflächendarstellung in Grau dargestellt. Das zuvor vorgeschlagene Öffnen und Schließen der Kopf- und Ankerdomäne von PBP2 bei der Bindung des Regulatorproteins MreC wird hier nicht modelliert15,23,24,87. Das Und-PP-Lipid ist in schwarzen Stäbchen dargestellt und die Disaccharide mit dem daran befestigten Pentapeptidstamm sind als Stäbchen in verschiedenen Farben dargestellt.

Um Prozessivität zu ermöglichen, muss die wachsende Und-PP-verknüpfte Glykankette bei jedem Katalysezyklus vom Akzeptor- zum Donor-Hohlraum übergehen. Basierend auf der relativen Flexibilität der Struktur, wie sie in den Kryo-EM-Karten beobachtet wird, nehmen wir an, dass eine Bewegung einen Durchgang zwischen den TM-Helices 3-7 auf der einen Seite und 1-2, 8-10 auf der anderen Seite schafft, um einen Kanal für zu bilden der Lipidschwanz von Und-PP. Wir untersuchten diese Hypothese von DEER, indem wir Sonden in Cysteinmutanten einfügten, die auf der Grundlage der Struktur entworfen und auf einem Cystein-freien Hintergrund eingeführt wurden. Diese Experimente lieferten Ergebnisse, die mit der Flexibilität der TM 3-7-Subdomäne übereinstimmen.

Unsere Struktur legt nahe, wie sich das wachsende Glykanpolymer von der RodA-GT-Stelle bis zum aktiven TP-Zentrum innerhalb von PBP2 erstrecken kann (Abb. 6). Durch die Kombination der Modellierung von Lipid II, Lipid IV usw. bis hin zu Lipid XX mit MD-Simulationen haben wir festgestellt, dass das wachsende Glykan in der Furche, die zur TP-Stelle führt, stabil ist und dass der Polyprenylschwanz in beiden Hohlräumen positioniert werden kann auftritt und dass nach der Synthese von Lipid XX die TP-Reaktion stattfinden kann. Cryo-EM, MD und DEER stellen fest, dass PBP2 dynamisch und flexibel ist, was die Aufnahme des wachsenden Glykanstrangs ermöglichen und dessen Bindung an das bereits vorhandene PG erleichtern könnte.

RodA hat strukturelle Ähnlichkeiten mit einer Reihe unterschiedlicher GTs26, einschließlich eines Ligandenbindungshohlraums, der durch eine TM-Helix erzeugt wird, die vom Haupthelixbündel wegragt, und einer kurzen amphipathischen Helix, die parallel zur Membran liegt und einen hochkonservierten Argininrest enthält, der für die Koordination sorgt zum Und-PP-Produkt der Reaktion26. Zu den Proteinen, die dieses funktionelle Motiv für die Und-PP-Bindung beibehalten, gehören die WaaL-O-Antigen-Ligase26 und andere Mitglieder der GT-C-Familie der Und-PP-abhängigen Transferasen und Polymerasen, für die es bis vor kurzem nur eine schlechte Strukturdefinition gab27. Die Sequenzkonservierung weist stark darauf hin, dass dieses Motiv artenübergreifend erhalten bleibt. Wir schlagen vor, dass der hier für RodA beschriebene Mechanismus bei anderen SEDS-Proteinen erhalten bleibt, einschließlich B. subtilis SpoVE, das als In-vivo-System für die vorliegende Studie dient.

Zusammenfassend haben wir mithilfe eines integrierten Ansatzes, der sich auf die Kryo-EM-Struktur des RodA-PBP2-Komplexes von E. coli in der naturnahen Umgebung einer Nanoscheibe konzentriert, kombiniert mit biochemischen Tests, genetischen Analysen, MD-Simulationen und DEER-Experimenten, generiert ein Modell dafür, wie diese Prozessmaschinerie zur Synthese von PG funktioniert. Diese Arbeit wird die Entwicklung strukturbasierter Inhibitoren für die essentielle GT-Aktivität von RodA und anderen SEDS-Lipid-II-Polymerasen erleichtern, für die keine bekannt ist.

Unter Verwendung der FtsW-Sequenz von E. coli als Keimzelle wurden 189 verschiedene bakterielle SEDS-Proteinorthologe durch Homologie identifiziert. Diese Orthologen wurden von NYCOMPS/COMPPÅ-Wissenschaftlern (New York Consortium on Membrane Protein Structure/Center on Membrane Protein Production and Analysis) in einer Hochdurchsatz-Pipeline mit einem Decahistidin-Tag am N- oder C-Terminus geklont, der vom Zielgen durch eine TEV-Spaltungsstelle getrennt war ), untergebracht im New York Structural Biology Center (NYSBC). Diese Ziele wurden durch Größenausschlusschromatographie in verschiedenen Detergenzien auf Expression und Monodispersität untersucht, wie zuvor beschrieben19,39,40. Fünf resultierende SEDS-Ziele, die für die strukturelle Charakterisierung am günstigsten waren, wurden zum Entwurf von SEDS-PBP-Fusionsproteinen verwendet, basierend auf den zuvor genetisch und funktionell charakterisierten Bacillus subtilis SpoVE-SpoVD- und E. coli FtsW-PBP3-Fusionen13. Die PBP-Partner der SEDS-Proteine ​​wurden identifiziert und mittels PCR aus genomischer DNA (bereitgestellt von NYCOMPS/COMPPÅ) der folgenden Bakterienstämme amplifiziert: Enterococcus faecalis V583, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578, Escherichia coli str. K-12 Unterstr. MG1655, Streptococcus pneumoniae TIGR4 und Escherichia fergusonii ATCC 35469. PBPs wurden durch Gibson-Assemblierung am C-terminalen Ende von SEDS-Genen mit einem TSGSGSGS-Linker zwischen dem SEDS-Gen und dem PBP-Gen eingefügt (siehe Ergänzungstabelle 4). Der Konstruktentwurf ist in der ergänzenden Abbildung 1a dargestellt. Alle resultierenden Klone wurden durch Sanger Sequencing (Macrogen) sequenzverifiziert. UniProt-IDs für SEDS-Proteine ​​und PBP-Proteine ​​der acht einzigartigen Fusionsproteine ​​sind unten in der Ergänzungstabelle 1 angegeben. Die Escherichia coli-Fusion (RodA UniProt ID 0ABG7; PBP2 UniProt ID P0AD65) im pNYCOMPS-N23-Vektor führte zu den besten Expressionsniveaus und wurde für Strukturstudien mittels Kryo-EM weitergeführt.

Die RodA-PBP2-Fusion aus E. coli im pNYCOMPS-N23-Vektor wurde verwendet, um 50 μl BL21(DE3) pLysS E. coli-kompetente Zellen zu transformieren, die über Nacht in 20 ml 2xYT-Medium, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin, gezüchtet wurden und 35 μg/ml Chloramphenicol bei 37 °C unter Schütteln mit 220 Umdrehungen pro Minute (RPM). Am nächsten Tag wurden 800 ml 2xYT-Medium mit 10 ml Starterkultur beimpft und bei 37 °C unter Schütteln mit 220 U/min wachsen gelassen, bis die OD600 0,8–1,0 betrug. Die Temperatur wurde auf 22 °C gesenkt und die Proteinexpression mit 0,2 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert, und die Kultur wurde 4 Stunden lang unter Schütteln bei 220 U/min inkubiert. Die Zellen wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 3220 xg und 4 °C geerntet, in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert und erneut zentrifugiert und dann bei –80 °C gelagert.

Zellpellets wurden aufgetaut und in Puffer resuspendiert, der 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), pH 7,0, 200 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 4 μl/100 ml RNase und 10 μg/ml feste Dnase enthielt , 1:1000 cOmpleteTM, EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche), 1 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Ein Glashomogenisator wurde verwendet, um die Zellpellets unter Verwendung von 6 ml Puffer pro 1 Gramm Zellpelletmasse zu resuspendieren. Die resuspendierten Zellen wurden lysiert, indem sie drei Passagen lang bei 15.000 psi durch einen Emulsiflex C3-Homogenisator (Avestin) geleitet wurden. Das Lysat wurde 30 Minuten lang bei 4 °C und 134.000 xg ultrazentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Membranpellets wurden unter Verwendung eines Glashomogenisators in 30 ml Waschpuffer mit hohem Salzgehalt (20 mM HEPES, 500 mM NaCl, 10 μg/ml feste Dnase, 4 μl/100 ml RNAse, 1 mM TCEP, 1:1000 cOmpleteTM) resuspendiert , EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche), 1 mM PMSF) pro 800 ml Zellkultur. Die resuspendierten Membranen wurden 30 Minuten lang bei 4 °C und 134.000 xg ultrazentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Membranpellets wurden mit einem Glashomogenisator und 30 ml Puffer (20 mM HEPES pH 7, 500 mM NaCl, 20 % Glycerin, 10 μg/ml feste DNase, 4 μl/100 ml Rnase, 1) resuspendiert und solubilisiert: 1000 cOmpleteTM, EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche), 1 mM TCEP und 1 mM PMSF und 1 % n-Dodecyl-β-D-Maltosid (DDM; Anatrace) pro 800 ml Zellkultur. Solubilisierende Membranen wurden für 10 Minuten rotiert 2 Stunden bei 4 °C. Anschließend wurde die Probe 30 Minuten lang bei 4 °C und 134.000 xg ultrazentrifugiert. Der Überstand wird gesammelt und mit 500 μl Ni-NTA-Agarosekügelchen (Qiagen) pro 800 ml Zellkultur kombiniert geerntet. Die Mischung rotiert 2 Stunden lang bei 4 °C. Die Perlen wurden dann auf eine Säule geladen und mit 10 Säulenvolumina Puffer gewaschen, der 20 mM HEPES pH 7, 500 mM NaCl, 60 mM Imidazol, pH 7,5, 20 % Glycerin enthielt und 0,1 % DDM. Das Protein wurde mit 3 Säulenvolumina Puffer eluiert, der 20 mM HEPES pH 7, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazol pH 7,5, 20 % Glycerin und 0,1 % DDM enthielt. Imidazol wurde aus dem eluierten Protein durch Pufferaustausch mit 20 mM HEPES pH 7, 500 mM NaCl, 20 % Glycerin, 0,1 % DDM und 1 mM TCEP unter Verwendung einer PD-10-Entsalzungssäule (Cytiva) entfernt. Die Konzentration des RodA-PBP2-Fusionsproteins wurde mit einem Nanotropfen-Spektrophotometer (Thermo Fisher) gemessen. Das RodA-PBP2-Fusionsprotein wurde mit 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphor-racglycerol (POPG) und dem Membrangerüstprotein 1E3D1 im Molverhältnis 1:300:5 kombiniert und 2 Stunden lang rotiert 4 °C. Der Mischung wurden Biokügelchen (Bio-Rad) zugesetzt, die man über Nacht bei 4 °C rotieren ließ. Biokügelchen wurden entfernt und die Mischung mit Ni-NTA-Agarosekügelchen (gleiches Volumen wie zuvor verwendet) kombiniert. Die Mischung wurde 2 Stunden lang bei 4 °C rotiert. Die Ni-NTA-Perlen wurden dann auf eine Säule geladen und mit 10 Säulenvolumina Puffer gewaschen, der 20 mM HEPES pH 7, 500 mM NaCl und 60 mM Imidazol enthielt. Rekonstituierte Nanoscheiben wurden durch Zugabe von 3 Säulenvolumina Puffer mit 20 mM HEPES pH 7, 500 mM NaCl und 300 mM Imidazol eluiert. Die eluierte Probe wird unter Verwendung eines 100-kDa-MWCO-Zentrifugalfilters (Amicon) auf 500 μl konzentriert. Der Nanodisc-Komplex wurde weiter gereinigt, indem er mit einem gefilterten und entgasten Puffer, der 20 mM HEPES pH 7, 150 mM NaCl und 1 mM TCEP enthielt, auf eine Superdex 200-Erweiterungssäule mit 10/300-Größenausschluss (Cytiva) geladen wurde.

Der gereinigte RodA-PBP2-Komplex wurde unter Verwendung eines 100-kDa-Konzentrators (Amicon) auf 0,66 mg/ml (5,9 μM) konzentriert. Die Probe wurde mit einem Vitrobot (Thermo Fisher) eingefroren, indem 3 µL des gereinigten Proteinkomplexes zu einem zuvor plasmagereinigten (Gatan Solarus) 0,6/1 µm Lochgoldgitter (Quantifoil UltrAuFoil) gegeben und mit 595 Filterpapier (Ted Pella, Inc) für 7,5 s mit einer Blotkraft von 3 und einer Wartezeit von 30 s bei 4 °C und >95 % Luftfeuchtigkeit. Die Bilder wurden mit einem Titan-Krios-Elektronenmikroskop (FEI) am Cryo-Electron Microscopy Center der Columbia University aufgenommen, das mit einem Energiefilter und einer K3-Filterkamera für die direkte Elektronendetektion (Gatan K3-BioQuantum) mit einer Pixelgröße von 0,83 Å ausgestattet war. Bei der Sammlung wurde eine Energiefilterschlitzbreite von 20 eV verwendet, die mit Leginon43 stündlich automatisch ausgerichtet wurde. Die Datenerfassung erfolgte mit einer Dosis von ~58,5 e-/Å2 über 50 Bilder (50 ms pro Bild) bei einer Dosisrate von etwa 16,1 e-/Pixel/s und einem festgelegten Defokusbereich von -1 μm bis -2,5 μm . Es wurde eine Objektivapertur von 100 µm verwendet. Im Rahmen einer zweitägigen Sammlung wurden 11.120 mikroskopische Aufnahmen gemacht.

Filmbilder wurden mithilfe der in cryoSPARC v.2.1244 implementierten Patch-Bewegungskorrektur unter Verwendung eines B-Faktors von 500 während der Ausrichtung ausgerichtet. Die Schätzung der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) wurde mit Patch CTF durchgeführt, wie in cryoSPARC v.2.12 implementiert. CrYOLO45 wurde zum Aufnehmen von Partikeln verwendet. Die Partikelauswahl ergab 3.147.165 Partikel, die dann in cryoSPARC mit einer 400-Pixel-Boxgröße viermal extrahiert wurden. Die Partikel wurden mithilfe der 2D-Klassifizierung in cryoSPARC v.3.2 klassifiziert, wobei eine Chargengröße pro Klasse von 400 verwendet wurde und „Max über Posen/Verschiebungen erzwingen“ deaktiviert war, mit 40 Online-EM-Iterationen und einer vollständigen Iteration. Es wurden 2D-Klassen mit genau definierten hochauflösenden Merkmalen ausgewählt, was zu einem Partikelstapel von 441.319 Partikeln führte. Die Partikel wurden dann mit einer Boxgröße von 400 Pixeln ohne Binning erneut extrahiert. Eine Runde der Ab-initio-Rekonstruktion wurde in cryoSPARC v.3.2 unter Verwendung von drei Klassen durchgeführt, mit einer maximalen Auflösung von 4 Å und einer anfänglichen Auflösung von 9 Å. Dies führte zu zwei spiegelbildlichen Klassen und einer Klasse mit verkürztem PBP2. Anschließend kehrten wir zum gebündelten Partikelstapel von 3.147.165 Partikeln zurück und führten eine heterogene Verfeinerung in cryoSPARC v3.2 durch, wobei wir die drei Klassen aus der Ab-initio-Rekonstruktion und zwei Täuschungsklassen sowie eine „Chargengröße pro Klasse“ von 30.000 verwendeten. Diese heterogene Verfeinerung wurde dreimal durchgeführt, wobei die Partikel aus den drei Ab-initio-Klassen der vorherigen heterogenen Verfeinerung als Eingabe für die nächste heterogene Verfeinerung verwendet wurden. Aus dieser abschließenden heterogenen Verfeinerung wurden die beiden besten Klassen ausgewählt (927.369 Partikel) und die Partikel wurden ohne Binning erneut extrahiert. Darauf folgte eine ungleichmäßige Verfeinerung mit einer endgültigen Auflösung von 3,24 Å. Die Partikel wurden durch heterogene Zwei-Klassen-Verfeinerung in cryoSPARC v3.2 weiter sortiert, wobei die Karte aus der ungleichmäßigen Verfeinerung mit 3,24 Å und eine tiefpassgefilterte Karte mit 10 Å als Eingabe verwendet wurden. Wir verwendeten eine „Chargengröße pro Klasse“ von 30.000 und eine anfängliche Auflösung von 5 Å und eine „Auflösung der Konvergenzkriterien“ von 100. Darauf folgte eine ungleichmäßige Verfeinerung mit einer endgültigen Auflösung von 3,17 Å (600.855 Partikel). Um eine höhere Auflösung für die TM-Region zu erreichen, wurden die Partikel durch eine 3D-Variabilitätsanalyse mit einer Maske um die TM-Region des Proteins mit Ausnahme der Nanoscheibe und einer Filterauflösung von 4,5 Å weiter getrennt. Die Partikel wurden in fünf Cluster geclustert und drei dieser Cluster (399.759 Partikel) wurden als Eingabe für eine ungleichmäßige Verfeinerung mit einer endgültigen Auflösung von 3,10 Å verwendet, gefolgt von einer lokalen Verfeinerung mit einer Maske um den TM-Bereich des Moleküls zu a endgültige Auflösung von 2,97 Å für die TM-Region. Um eine höhere Auflösung für den periplasmatischen Teil von PBP2 zu erreichen, verwendeten wir die 600.855 Partikel aus der vorherigen ungleichmäßigen Verfeinerung und führten eine 3D-Variabilitätsanalyse mit einer Maske um den periplasmatischen Teil von PBP2 durch. Die Partikel wurden in zehn Cluster geclustert und die sechs besten Cluster wurden als Eingabe für die ungleichmäßige Verfeinerung (236.435 Partikel) mit einer endgültigen Auflösung von 3,23 Å verwendet. Darauf folgte eine Verfeinerung der Strahlneigung durch Bildverschiebungsgruppen, gefolgt von einer weiteren ungleichmäßigen Verfeinerung auf eine endgültige Auflösung von 3,08 Å. Wir sortierten die Partikel weiter mit einer weiteren Runde der 3D-Klassifizierung in cryoSPARC unter Verwendung von vier Klassen, einer Zielauflösung von 4 Å und einer Online-Erwartungsmaximierung (O-EM) von 10.000 Partikeln pro Epoche. Dadurch wurde ein Stapel von Partikeln identifiziert, den wir mithilfe einer ungleichmäßigen Verfeinerung weiter auf eine endgültige Auflösung von 3,14 Å verfeinerten. Abschließend wurde eine lokale Verfeinerung unter Verwendung einer Maske um den periplasmatischen Bereich bis zu einer endgültigen Auflösung von 2,95 Å durchgeführt.

Die in Abb. 5a dargestellte 3D-Variabilitätsanalyse basiert auf einer Teilmenge von Partikeln, bei denen eine lokale Verfeinerung mit einer Maske um den Transmembranbereich herum vorgenommen wurde. Anhand dieser Karte und mit einer Maske um den periplasmatischen Teil von PBP2 wurde eine 3D-Variabilität durchgeführt, wobei die Partikel in 6 Cluster unterteilt wurden.

Ein erstes Modell von RodA und der TM-Helix von PBP2 wurde als Homologiemodell zur veröffentlichten komplexen Röntgenkristallstruktur RodA-PBP2 erstellt17. Das Modell wurde in Chimera46 als starrer Körper an die Karte angepasst, anschließend wurde das Modell mit Namdinator21 an die aktuelle Dichte angepasst und mit Coot47,48,49 und PHENIX50,51 iterativ weiter verfeinert. Für den löslichen Teil von PBP2 wurde die zuvor veröffentlichte Röntgenstruktur des löslichen Teils von PBP222 als Eingabe in Namdinator21 verwendet und unter Verwendung von Coot47,48,49 und PHENIX50,51 iterativ weiter verfeinert.

Eine Hohlraumsuche mit dem Solvent Extractor vom Voss Volume Voxelator Server52 wurde mit einem Außensondenradius von 10 Å und einem Innensondenradius von 2 Å durchgeführt. Chimera46, PyMOL und ChimeraX53 wurden verwendet, um die Strukturen in den Abbildungen zu visualisieren.

Die dansylierte Lysinversion für Gelvisualisierungsstudien der GT-Aktivität (Dansyl-Lysin-Lipid II) wurde durch In-vitro-Rekapitulation des Synthesewegs wie zuvor beschrieben54 hergestellt.

Die Glycosyltransferase-Aktivität von RodA-PBP2 wurde durch Visualisierung fluoreszierend markierter Dansyl-Lipid-II-Moleküle mithilfe einer auf Tris-Tricin-Acrylamidgel basierenden Elektrophoresemethode55 nachgewiesen. Reinigungsmittellösliches RodA-PBP2-Protein (1,5 μl) in einer Konzentration von 2,7 μM in 300 mM Imidazol, 250 mM NaCl, 20 mM HEPES, 0,05 % n-Dodecyl-BD-Maltosid (DDM), 20 % Glycerin wurde zu 13,5 μl hinzugefügt Reaktionspuffer (10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 % DMSO, 0,03 % Lauryldimethylaminoxid (LDAO), 10 μM Dansyllysin Lipid II) auf eine Endproteinkonzentration von 0,27 μM. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert, um eine RodA-abhängige Polymerisation von Lipid II zu ermöglichen.

Das resultierende Lipid-II-Polymer wurde bei 95 °C denaturiert, um die Reaktion zu stoppen, und vor der Elektrophorese mit 5x Beladungsfarbstoff (50 mM Tris-HCl pH 8,8, 4 % SDS, 40 % Glycerin, 0,01 % Bromphenolblau, DTT 200 mM) gemischt auf einem Biorad Criterion 16,5 % Gellauf bei 110 V für 80 Minuten mit Anodengel-Laufpuffer (0,1 M Tris-HCl pH 8,8) und Kathodengel-Laufpuffer (0,1 M Tris-HCl pH 8,25, 0,1 M Tricin, 0,1 % SDS) . Das Gel wurde durch 10-sekündige UV-Bestrahlung auf einem BioRad GelDoc-Bildgebungssystem unter Verwendung der Biorad-Bilderfassungssoftware sichtbar gemacht. Konzentrationsabhängige Tests wurden auf die gleiche Weise durchgeführt, wobei veränderte Konzentrationen von RodA-PBP2 oder Lipid II hinzugefügt wurden. Mit MTSL markierte Proben wurden vor dem Test wie in der nachstehenden EPR-Probenvorbereitung beschrieben vorbereitet.

Die fluoreszierende BocillinTM-Markierung von PBP2 wurde durch 15-minütige Inkubation gereinigter 25 μl RodA-PBP2-Fraktionen mit 1 μl Bocillin (1 mg/ml) durchgeführt. Die resultierenden Mischungen wurden auf einem 4–15 %igen SDS-Seitengel laufen gelassen und dann 4 s lang mit einem BioRad-Geldokumentationssystem56 visualisiert. Die Bilder wurden maximal so dargestellt, dass sie die Fluorescein-Leiter und keinen anderen Marker enthielten, sodass nur mit Bocillin gefärbte Proteine ​​auf dem Gel sichtbar gemacht wurden.

Alle Gelspuren wurden mindestens dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Die Mutagenese von pNYCOMPS-N23 RodA-PBP2 wurde unter Verwendung des QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent) mit benutzerdefinierten Primern durchgeführt (siehe Ergänzungstabelle 4).

Ein Mehrfachsequenz-Alignment für RodA wurde mit MMseqs257 erstellt, indem sowohl UniRef100- als auch Umgebungssequenzsätze nach homologen Proteinen durchsucht wurden. Weblogo358 wurde verwendet, um die Konservierung der ausgerichteten Sequenzen von RodA als Weblogo zu analysieren und darzustellen, wobei die E. coli K12 W3110-Sequenz als Referenz diente. Consurf wurde verwendet, um die Aminosäurekonservierung auf der Oberfläche von RodA59 darzustellen.

Die Koevolutionsanalyse wurde mit GREMLIN60 durchgeführt. Die E. coli K12 W3110-Sequenzen von RodA (mrdb) und PBP2 (mrdA) wurden als Eingabesequenzen verwendet, um Homologe mit einem Cut-off von E-10 zu identifizieren. Basierend auf diesem gepaarten Sequenz-Alignment wurde GREMLIN mit Standardparametern verwendet, um die koevolutionären Kontakte entweder innerhalb von RodA oder PBP2 und auch zwischen RodA und PBP2 zu finden.

Zwei native Cysteine ​​in der RodA-PBP2-Fusion von E. coli (pNYCOMPS-N23-Vektor) wurden zu Glycin und Alanin (Cys82Gly und Cys133Ala) mutiert und anschließend wurden Cysteine ​​in den resultierenden cysteinfreien Hintergrund zur ortsgerichteten Spinmarkierung (SDSL) eingeführt Reste, von denen angenommen wird, dass sie durch DEER-EPR-Spektroskopie auf der Grundlage der verfügbaren Strukturinformationen informative Abstandsverteilungen erzeugen. Die gesamte Mutagenese wurde mit dem QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent) oder dem QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent) mit benutzerdefinierten Primern durchgeführt (siehe Ergänzungstabelle 4). Alle Mutanten wurden wie oben beschrieben auf enzymatische Funktion und Bocillin-Bindung getestet. Zur Vorbereitung der Spin-Markierung wurden RodA-PBP2-Mutanten wie oben beschrieben in Detergens gereinigt, aber unter Verwendung einer PD-10-Entsalzung gegen einen nicht reduzierenden Puffer ausgetauscht, der 20 mM HEPES pH 7, 500 mM NaCl, 20 % Glycerin, 0,1 % DDM enthielt Säule (Cytiva) nach der Elution. S-(2,2,5,5-Tetramethyl-2,5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl)methylmethansulfonothiolat (MTSL; Santa Cruz Biotechnology) wurde in einem Molverhältnis von MTSL zu Protein von 15:1 zugegeben. Die Reaktion wurde über Nacht bei 4 °C unter Rühren und vor Licht geschützt inkubiert. Überschüssiges Spin-Label wurde mit einer PD-10-Entsalzungssäule (Cytiva) unter Verwendung desselben nichtreduzierenden Puffers entfernt. Das resultierende Protein wurde auf 100–150 mM konzentriert. Für Dauerstrich-EPR-Experimente (CW) wurden 7 μl konzentriertes Protein in Pyrex-Kapillaren (0,6 mm Innendurchmesser x 0,84 mm Außendurchmesser; Vitrocom) geladen und bei Raumtemperatur gemessen. Für gepulste (DEER) EPR-Experimente wurde der konzentrierten Proteinprobe deuteriertes Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 20 % (v/v) zugesetzt und 15–20 μl der Probe wurden in Quarzkapillarröhrchen (1,6 mm Außendurchmesser x 1,1 mm Innendurchmesser) eingefroren ; Vitrocom) unter Verwendung eines Bades aus Trockeneis und Isopropanol. Gefrorene Proben wurden bei -80 °C gelagert, bis gepulste EPR-Daten erfasst wurden.

CW-EPR-Messungen wurden mit einem X-Band-Bruker-EMX-Dauerstrichspektrometer mit einem dielektrischen Resonator ER4123D (Bruker Biospin) bei Raumtemperatur durchgeführt. CW-Spektren wurden mit der Lab-VIEW-Software (bereitgestellt von C. Altenbach, University of California in Los Angeles) grundlinienkorrigiert und normalisiert. Gepulste (DEER) EPR-Messungen wurden bei 50 K mit einem Q-Band Bruker E580 EPR-Spektrometer (Bruker Biospin) durchgeführt, das mit einem 300-Watt-Wanderfeldröhrenverstärker (Applied Systems Engineering) und einem EN5107D2-Resonator ausgestattet war. Für alle Messungen wurde eine Standard-DEER-Sequenz mit vier Impulsen verwendet, wobei die Impulslängen p/2 und p je nach Probe variierten. Eine Pumpfrequenz wird auf das Maximum des Nitroxidspektrums eingestellt und die beobachtete Frequenz wird auf 75 MHz niedriger eingestellt. Während der Datenerfassung wurden zunehmende Verzögerungen zwischen den Impulsen in Schritten von 16 ns mit einem 16-stufigen Phasenzyklus genutzt. Die Akkumulationszeiten lagen typischerweise zwischen 12 und 36 Stunden, mit einer dipolaren Entwicklungszeit zwischen 3 und 3,5 ms. Dipolare Evolutionsdaten wurden mit DEERAnalysis61 mit Gaußscher Modellanpassung oder dem DEERNet-Plugin für neuronale Netzwerke62 verarbeitet. MTSL-Rotamere wurden an Strukturen angehängt, die aus Kryo-EM-Daten oder aus MD-Simulationen in silico mit Multiscale Modeling of Macromolecules (MMM)63 unter Verwendung der Standard-Rotamer-Bibliothek erhalten wurden. Aus den resultierenden Strukturen wurden Nitroxid-zu-Nitroxid-Abstände berechnet und zum Vergleich mit experimentellen Daten auf den nächsten Angström genau gruppiert.

Die Tests wurden wie in Fay et al.13 beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt wurden Mutationen in ein SpoVE-SpoVD-Konstrukt in einem Stamm eingeführt, dem spoVD und spoVE fehlten, und die Sporulation (Hitzeempfindlichkeit) wurde bewertet.

Autodock vina-carb64 wurde verwendet, um Lipid II-, Lipid II C55 mDAP- und Peptidoglycan-Fragmente an die identifizierten Hohlräume und Spalten des RodA-PBP2-Komplexes anzudocken. Angedockte Posen wurden in CHARMM36m umgewandelt und die Energie minimiert, um die Bindungsorientierungen zu optimieren und angedockte Fragmente von Peptidoglycan zu ligieren, um die Bildung der längeren polymerisierten Lipide, z. B. Lipid XX, zu ermöglichen, wobei die Parameter auf der Grundlage der zuvor veröffentlichten entwickelt wurden65.

Alle grobkörnigen (CG) MD-Simulationen verwendeten das Martini-3-Kraftfeld66,67. Mit Martinize266 wurden Martini-3-Topologien mit elastischen Netzwerken für RodA- und PBP2-Proteinketten generiert. Das DSSP-Programm wurde für die Sekundärstrukturzuordnung68 verwendet und die Kraftkonstanten des elastischen Netzwerks innerhalb der Kette wurden auf 500 kJ mol–1 nm–2 mit oberen und unteren Grenzwerten für die elastische Bindung von 1,0 bzw. 0,5 nm eingestellt.

Martini-3-Perlentypen und die Zuordnung zum Lipid-II-Molekül wurden manuell durchgeführt, wobei zuvor veröffentlichte Martini-2-Lipid-II-Parameter69 konvertiert wurden. Änderungen wurden entsprechend der Aminosäurekügelchen in Martini 367 und den vorgeschlagenen Kügelchentypen aus dem Protokoll zur Herstellung kleiner Moleküle in Martini 370 vorgenommen. Um die Parameter für Lipid II zu verfeinern, wurden atomistische Simulationen (3 × 100 ns) mit zuvor veröffentlichten Parametern durchgeführt65 erhalten von den Autoren in einer PE:PG (3:1)-Membran mit einer einzelnen Kopie von Lipid II. CG-Simulationen wurden auch mit der gleichen Zusammensetzung durchgeführt (5 × 1 μs). Darstellungen von CG- und atomistischen Lipid-II-Molekülen sind in der ergänzenden Abbildung 5d dargestellt. Verteilungen von Abständen und Winkeln wurden mit den GMX-Werkzeugen Abstand und Winkel gemessen. Für die Gesamtatomsimulationen wurden die Atome nach ihren Perlentypen gruppiert und das Geometriezentrum gemessen. Der von der Lösungsmitteloberfläche zugängliche Bereich wurde mit dem GMX-Tool Sasa gemessen. Diagramme wurden mit Matplotlib71 erstellt.

Alle Modellsysteme wurden in periodischen 3D-Boxen unter Verwendung der Methoden Memembed72 und insane73 hergestellt, um proteinsolvatisierende symmetrische PE/PG-Doppelschichten (4:1-Verhältnis von PE:PG) zu erzeugen. Wo zutreffend, wurden zwei Moleküle Lipid II an zufälligen Positionen im oberen (periplasmatischen) Blättchen positioniert. Die anfänglichen Kastenabmessungen wurden auf 5,0 nm plus dem maximalen Proteindurchmesser eingestellt, etwa 11 x 11 x 11 nm für RodA- und 13 x 14 x 15 nm für RodA-PBP2-Systeme. Unter Verwendung von Wahnsinn wurden die verbleibenden Hohlräume mit Wasserkügelchen gefüllt, wobei Natrium- und Chloridionen an zufällig platzierten Positionen platziert wurden, was einer neutralisierenden Salzkonzentration von 0,15 M entspricht. Die Systeme wurden dann einer Minimierung des steilsten Abfalls mit einer Toleranz von Fmax = 100 kJ mol–1 nm– unterzogen. 2. Insgesamt bestanden die RodA- und RodA-PBP2-Systeme aus etwa 11.000 bzw. 24.000 Perlen.

Alle Produktions-CG-Simulationen wurden mit GROMACS 202174 und dem integrierten Leap-Frog-Integrator mit einem Zeitschritt von 0,02 ps durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Bei allen Produktionssimulationen wurden isotherm-isobare Ensembles bei 310 K unter Verwendung des V-Rescale-Thermostats (τt = 1,0)75 und des C-Rescale-Barostaten für semiisotrope Druckkopplung bei 1,0 bar (τp = 12,0)76 abgetastet. Bei den Gleichgewichtsläufen vor der Produktion wurden der Berendsen-Barostat und ein Zeitschritt von 0,01 ps verwendet. Für Protein-, Lipid- und Lösungsmittelmoleküle (dh Wasser und Ionen) wurden separate Kopplungsgruppen verwendet. Für die Elektrostatik wurde die Reaktionsfeldmethode mit einem Coulomb-Grenzwert von 1,1 nm (εr = 15 und εr = ∞ für r > 1,1 nm) verwendet, und für Van-der-Waals-Wechselwirkungen (VdW) wurde ebenfalls ein Grenzwert von 1,1 verwendet nm (beide mit dem Verlet-Cut-off-Schema). Zur Behandlung holonomischer Einschränkungen wurde der bis zur 4. Ordnung erweiterte P-LINCS-Algorithmus verwendet77. Jedes System wurde 10 ns lang äquilibriert, danach wurden 10 μs Produktionsläufe aus den Koordinaten und Geschwindigkeiten der endgültigen Bilder der Äquilibrierungstrajektorien vorbereitet. Für RodA und RodA-PBP2 wurden 50 Wiederholungen der Produktionssimulationen durchgeführt.

Dichtekarten für die MD-Simulation in Abb. 3d wurden erstellt, indem alle auf RodA zentrierten Wiederholungstrajektorien verkettet, dann die kleinsten Quadrate an RodA-Grundgerüstkügelchen angepasst wurden (unter Verwendung von MDanalysis78) und die von der Community entwickelte Open-Source-Bibliothek PLUMED79 zum Protokollieren des x verwendet wurden und y-Koordinaten der geometrischen Zentren der Lipid-II-Phosphatkügelchen. Aufgrund der Standardorientierung des Proteins in der Doppelschicht (von Memembed) steht die z-Achse der Simulationsbox immer senkrecht zur Membranebene und das resultierende Histogramm der x- und y-Koordinaten ist funktionell eine der Doppelschicht zugewandte 2D-Projektion von die Teilchendichte. Die Seaborn-API wurde verwendet, um die in den endgültigen Zahlen dargestellte Schätzung der Kerneldichte durchzuführen. Eine Lipid-II-Interaktionsanalyse wurde mit PyLipID25 durchgeführt, um Bindungsstellen, interagierende Reste und Belegungszeiten für die gebundenen Lipid-II-Moleküle aus den CG-Simulationen zu identifizieren.

Atomistische Simulationen für Apo RodA und RodA-PBP2 wurden mit der gleichen Pipeline wie CG-Simulationen erstellt, außer dass das Martini 2.2-Kraftfeld66 und Positionsbeschränkungen für Proteinrückgratkügelchen mit Kraftkonstanten von 1000 kJ mol–1 nm–2 verwendet wurden. Nach 50 ns CG-Äquilibrierung wurden die CG-Systeme mithilfe des CG2AT-Programms mit der integrierten „Alignment“-Methode in atomistische Systeme umgewandelt, um die Proteingeometrie während der Umwandlung in Richtung der vorbereiteten EM-Struktur (Prä-CG-Relaxation) zu lenken80. Die Ausrichtung ergab einen typischen RMSD von nur 0,14 nm im Verlauf der CG-Äquilibrierung. Insgesamt ermöglichte dieses Protokoll die Herstellung von Allatom-Membranproteinsystemen in gut ausgeglichenen Doppelschichten.

Wo relevant, wurden Lipid II und seine polymerisierten Formen (d. h. Lipid IV, Lipid XX usw.) nach der Umwandlung (d. h. vor der atomistischen Äquilibrierung) zu den atomistischen Systemen hinzugefügt, indem die angedockten Konformationen in den beiden beobachteten Bindungshohlräumen ausgerichtet und energieminimiert wurden ( A und B).

Produktionssimulationen bestanden aus drei Wiederholungen von 500 ns, die jeweils von einer bestimmten Gleichgewichtsbahn aus fortgeführt wurden. Das System, das die Kryo-EM-Struktur von RodA-PBP2 mit gebundenem Und-PP darstellt, wurde für drei Wiederholungen von jeweils 1 μs simuliert. Alle atomistischen Simulationen verwendeten den GROMACS 2021 Leap-Frog-Integrator mit einem Zeitschritt von 0,002 ps, das CHARMM36m-Kraftfeld81 und das TIP3P-Wassermodell82,83. Simulationen wurden im isothermen-isobaren Ensemble bei 310 K mit dem V-Rescale-Thermostat (τt = 0,1) und dem Parrinello-Rahman-Barostat für semiisotrope Druckkopplung bei 1,0 bar (τp = 1,0)84,85 durchgeführt. Für die Behandlung der Elektrostatik86 wurde ein Partikelnetz-Ewald (PME) verwendet, und für VDW-Wechselwirkungen wurde ein (Verlet-)Grenzwert von 1,2 nm verwendet. Alle Bindungen, an denen Wasserstoffe beteiligt sind, wurden in holonome Einschränkungen umgewandelt, die mit dem P-LINCS-Algorithmus 4. Ordnung behandelt wurden.

Für die PBP2-Dynamik-Heatmap in Abb. 4 wurde jede Apo-RodA-PBP2-Produktionssimulation im ersten Trajektorienrahmen mithilfe von MDAnalysis im quadratischen Mittelwert an RodA angepasst, bevor die simulierten B-Faktoren mithilfe des GROMACS-Dienstprogramms gmx rmsf berechnet wurden. Die in der endgültigen Abbildung dargestellten Werte stammen aus der Mittelung über die fünf Wiederholungssimulationen und wurden vor der Äquilibrierung auf die minimierte RodA-PBP2-Struktur abgebildet.

Eine lineare Interpolation der Lipid-II-Polymerisation wurde mit dem GROMACS-Tool gmx morph erstellt. Dieser Film veranschaulicht die Verlängerung von PG, mögliche Konformationsänderungen von RodA im Zusammenhang mit der Polymerisation und den möglichen Übergang von Lipid-gebundenen Produkten von Hohlraum B in Hohlraum A, um die Bindung des nächsten Lipid II zu ermöglichen.

Aus den atomistischen MD-Simulationen mit gebundenem Lipid-II-VI wurden Trajektorienrahmen basierend auf einfachen Abstandsgrenzwerten von 6,5 Å zwischen D262, der Lipid-C4-Hydroxylgruppe (Donor) der Stelle B und dem Lipid-C1-Atom (Akzeptor) der Stelle A gefiltert geeignete Ausgangsgeometrien der katalytisch relevanten Atome hervorzuheben. Aus ausgewählten Schnappschüssen wurden daraus Clustermodelle für QM-Minimierungen erstellt. QM-Atome umfassten einen plattenförmigen Bereich von RodA, der D262 und die gebundenen Lipid-Kopfgruppen an jeder Stelle umgab. RodA-Atome bestanden aus 6 separaten ganzen Peptidfragmenten, die sich über die Reste R48–K49, K97–W102, R109–Q111, D159–L160, E258–F263 und S340–G343 erstreckten. Für jedes Substratmolekül waren zwei vollständige Glykaneinheiten (GlcNAc-MurNAc) enthalten (d. h. Lipid II), aber Undecaprenyl-Lipidschwänze wurden nach dem ersten Isoprenylfragment abgeschnitten, und in ähnlicher Weise wurden Pentapeptidketten am L-Ala-Cα-Atom (einschließlich) abgeschnitten Sidechain). Bei der Definition der Grenzen der Peptidfragmente wurden nur (unpolare) Bindungen zwischen Kohlenstoffatomen der Hauptkette geschnitten, daher wurden immer Schnitte zwischen Cα und Amidkohlenstoffen (Carbonyl) an beiden Enden vorgenommen (so dass immer N-terminale Enden der Fragmente vorhanden sind). enthalten die Carbonyleinheit aus dem vorhergehenden Rest). Alle durchtrennten Bindungen wurden mit hinzugefügten Wasserstoffatomen abgedeckt und alle Grenzatome wurden während der Optimierungen an ihrem Platz fixiert (dh mit eingefrorenen kartesischen Koordinaten). Insgesamt bestand das Clustermodell aus insgesamt 590 Atomen mit einer Gesamtladung von -1 und einer Singulett-Multiplizität. Alle gemeldeten QM-Berechnungen verwendeten das ORCA-Programm (Version 5.0.3) und das semiempirische GFN2-xTB-Dichtefunktional mit impliziter ALPB-Solvatisierung (Wasser). Um Produktstrukturen aus Reaktantenstrukturen zu erhalten, wurden Minimierungen mit kuratierten harmonischen Beschränkungen gesteuert, die die Pyrophosphat-Abgangsgruppenbindung verlängern und entlang der Koordinate ziehen, die die glykosidische Bindung bildet. Anschließend wurde die Clustergeometrie ohne die Beschränkungen wieder entspannt und näherte sich dem nächstgelegenen Produkt an Minimum. Das ergänzende Video wird aus einer teilweise konvergenten NEB-Berechnung interpoliert, die aus 8 Bildern besteht, die Produkt- und Reaktantengeometrien verbinden, die aus einem repräsentativen Schnappschuss minimiert wurden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Dichtekarten wurden in der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) mit den Zugangscodes EMD-41303, EMD-41304 und EMD-41299 hinterlegt. Das Modell wurde in der Protein Data Bank (PDB) mit dem Zugangscode 8TJ3 hinterlegt. Alle Daten sind im Manuskript oder den ergänzenden Materialien verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument in der Quelldatendatei bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Typas, A., Banzhaf, M., Gross, CA & Vollmer, W. Von der Regulierung der Peptidoglykansynthese bis zum Bakterienwachstum und der Morphologie. Nat. Rev. Microbiol 10, 123–136 (2011).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Skalweit, MJ & Li, M. Bulgecin A als β-Lactam-Verstärker für Carbapenem-resistente klinische Isolate von Pseudomonas aeruginosa und Carbapenem-resistentem Acinetobacter baumannii mit verschiedenen Resistenzmechanismen. Drogen Des. Entwickler Dort. 10, 3013–3020 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Page, JE & Walker, S. Natürliche Produkte, die auf die Zellhülle abzielen. Curr. Meinung. Mikrobiol. 61, 16–24 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Novak, R., Charpentier, E., Braun, JS & Tuomanen, E. Signalübertragung durch ein Todessignalpeptid: Aufdeckung des Mechanismus der Bakterientötung durch Penicillin. Mol. Zelle 5, 49–57 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zgurskaya, HI, López, CA & Gnanakaran, S. Permeabilitätsbarriere gramnegativer Zellhüllen und Ansätze zu ihrer Umgehung. ACS-Infektion. Dis. 1, 512–522 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Silver, LL Lebensfähige Screening-Ziele im Zusammenhang mit der bakteriellen Zellwand. Ann. N. Y. Acad. Wissenschaft. 1277, 29–53 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Antibiotika-Entdeckung und -Entwicklung, Bände 1 und 2. Antibiotika-Entdeckung und -Entwicklung, Bände 1 und 2, 79–117 (2012).

Egan, AJF, Errington, J. & Vollmer, W. Regulierung der Peptidoglycan-Synthese und -Remodellierung. Nat. Rev. Microbiol 18, 446–460 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kashammer, L. et al. Kryo-EM-Struktur des bakteriellen Divisome-Kernkomplexes und des Antibiotika-Ziels FtsWIQBL. Nat. Microbiol 8, 1149–1159 (2023).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meeske, AJ et al. SEDS-Proteine ​​sind eine weit verbreitete Familie bakterieller Zellwandpolymerasen. Natur 537, 634–638 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sjodt, M. et al. Struktur der Peptidoglycan-Polymerase RodA, aufgeklärt durch evolutionäre Kopplungsanalyse. Natur 556, 118–121 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sauvage, E., Kerff, F., Terrak, M., Ayala, JA & Charlier, P. Die Penicillin-bindenden Proteine: Struktur und Rolle bei der Peptidoglycan-Biosynthese. FEMS Microbiol Rev. 32, 234–258 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fay, A., Meyer, P. & Dworkin, J. Wechselwirkungen zwischen spät wirkenden Proteinen, die für die Peptidoglycansynthese während der Sporulation erforderlich sind. J. Mol. Biol. 399, 547–561 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Egan, AJ, Cleverley, RM, Peters, K., Lewis, RJ & Vollmer, W. Regulierung des bakteriellen Zellwandwachstums. FEBS J. 284, 851–867 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rohs, PDA et al. Eine zentrale Rolle für PBP2 bei der Aktivierung der Peptidoglycan-Polymerisation durch die bakterielle Zellverlängerungsmaschinerie. PLoS Genet 14, e1007726 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Shlosman, I. et al. Allosterische Aktivierung der Zellwandsynthese während des Bakterienwachstums. Nat. Komm. 14, 3439 (2023).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sjodt, M. et al. Strukturelle Koordination von Polymerisation und Vernetzung durch einen SEDS-bPBP-Peptidoglycan-Synthase-Komplex. Nat. Microbiol 5, 813–820 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McLeod, MP et al. Das vollständige Genom von Rhodococcus sp. RHA1 bietet Einblicke in ein katabolisches Kraftpaket. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 103, 15582–15587 (2006).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mancia, F. & Love, J. Hochdurchsatz-Expression und Reinigung von Membranproteinen. J. Struktur. Biol. 172, 85–93 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kocaoglu, O. & Carlson, EE Penicillin-bindende Protein-Bildgebungssonden. Curr. Protokoll. Chem. Biol. 5, 239–250 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kidmose, RT et al. Namdinator – automatische molekulardynamische flexible Anpassung von Strukturmodellen in Kryo-EM- und Kristallographie-Experimentkarten. IUCrJ 6, 526–531 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Levy, N. et al. Strukturelle Basis für die Hemmung des Penicillin-bindenden Proteins (PBP) 2 von E. coli, eine Plattform für das Arzneimitteldesign. J. Med. Chem. 62, 4742–4754 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Contreras-Martel, C. et al. Molekulare Architektur des bakteriellen Zellwandsynthesekomplexes PBP2–MreC. Nat. Komm. 8, 776 (2017).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, PLoS Genet 16, e1009276 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Song, W. et al. PyLipID: Ein Python-Paket zur Analyse von Protein-Lipid-Wechselwirkungen aus molekulardynamischen Simulationen. J. Chem. Theorieberechnung. 18, 1188–1201 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ashraf, KU et al. Strukturelle Grundlagen der Lipopolysaccharid-Reifung durch die O-Antigen-Ligase. Natur 604, 371–376 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alexander, JAN & Locher, KP Neue strukturelle Erkenntnisse zu C-Typ-Glycosyltransferasen. Curr. Meinung. Struktur. Biol. 79, 102547 (2023).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Galley, NF, O'Reilly, AM & Roper, DI Aussichten für neuartige Inhibitoren von Peptidoglycan-Transglycosylasen. Bioorg. Chem. 55, 16–26 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, Y. et al. Identifizierung des potenziell aktiven Zentrums der septalen Peptidoglycan-Polymerase FtsW. PLoS Genet 18, e1009993 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schwartz, B., Markwalder, JA, Seitz, SP, Wang, Y. & Stein, RL Eine kinetische Charakterisierung der Glycosyltransferase-Aktivität von Eschericia coli PBP1b und Entwicklung eines kontinuierlichen Fluoreszenzassays. Biochemistry 41, 12552–12561 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zawadzka-Skomiał, J. et al. Charakterisierung des bifunktionellen Glycosyltransferase/Acyltransferase-Penicillin-bindenden Proteins 4 von Listeria monocytogenes. J. Bakteriol. 188, 1875–1881 (2006).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Terrak, M. & Nguyen-Distèche, M. Kinetische Charakterisierung der monofunktionellen Glycosyltransferase aus Staphylococcus aureus. J. Bakteriol. 188, 2528–2532 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bannwarth, C., Ehlert, S. & Grimme, S. GFN2-xTB – Eine genaue und breit parametrisierte, selbstkonsistente, eng bindende quantenchemische Methode mit Multipol-Elektrostatik und dichteabhängigen Dispersionsbeiträgen. J. Chem. Theory Comput 15, 1652–1671 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yakovlieva, L. & Walvoort, MTC-Prozessivität in bakteriellen Glykosyltransferasen. ACS Chem. Biol. 15, 3–16 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Welsh, MA, Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D. & Walker, S. Richtung des Kettenwachstums und Substratpräferenzen von Form, Verlängerung, Teilung und Peptidoglycan-Glycosyltransferasen der Sporulationsfamilie. Marmelade. Chem. Soc. 141, 12994–12997 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Knott, BC, Crowley, MF, Himmel, ME, Zimmer, J. & Beckham, GT Simulationen der Cellulosetranslokation in der bakteriellen Cellulosesynthase legen einen Regulierungsmechanismus für die dimere Struktur von Cellulose nahe. Chem. Wissenschaft. 7, 3108–3116 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morgan, JL, McNamara, JT & Zimmer, J. Mechanismus der Aktivierung der bakteriellen Cellulosesynthase durch zyklisches Di-GMP. Nat. Struktur. Mol. Biol. 21, 489–496 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hudson, KL et al. Kohlenhydrat-aromatische Wechselwirkungen in Proteinen. Marmelade. Chem. Soc. 137, 15152–15160 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mancia, F. & Love, J. Hochdurchsatzplattformen für die strukturelle Genomik integraler Membranproteine. Curr. Meinung. Struktur. Biol. 21, 517–522 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bruni, R. & Kloss, B. Hochdurchsatzklonierung und Expression integraler Membranproteine ​​in Escherichia coli. Curr. Protokoll. Proteinwissenschaft. 74, 29 26 21–29 26 34 (2013).

Artikel Google Scholar

Gibson, DG et al. Enzymatischer Aufbau von DNA-Molekülen mit bis zu mehreren hundert Kilobasen. Nat. Methoden 6, 343–345 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gibson, DG Enzymatische Assemblierung überlappender DNA-Fragmente. Methoden Enzymol. 498, 349–361 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Suloway, C. et al. Automatisierte Molekularmikroskopie: das neue Leginon-System. J. Struktur. Biol. 151, 41–60 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Punjani, A., Rubinstein, JL, Fleet, DJ & Brubaker, MA cryoSPARC: Algorithmen für die schnelle unbeaufsichtigte Kryo-EM-Strukturbestimmung. Nat. Methoden 14, 290–296 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wagner, T. et al. SPHIRE-crYOLO ist ein schneller und präziser vollautomatischer Partikelpicker für Kryo-EM. Komm. Biol. 2, 218 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera – ein Visualisierungssystem für explorative Forschung und Analyse. J. Comput Chem. 25, 1605–1612 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: Modellbauwerkzeuge für molekulare Grafiken. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 60, 2126–2132 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Emsley, P., Lohkamp, ​​B., Scott, WG & Cowtan, K. Merkmale und Entwicklung von Blässhuhn. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 66, 486–501 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Casanal, A., Lohkamp, ​​B. & Emsley, P. Aktuelle Entwicklungen in Coot für den makromolekularen Modellaufbau von Elektronenkryomikroskopie und kristallographischen Daten. Proteinwissenschaft. 29, 1069–1078 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Afonine, PV et al. Auf dem Weg zur automatisierten kristallographischen Strukturverfeinerung mit phenix.refine. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 68, 352–367 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Afonine, PV et al. Realraumverfeinerung in PHENIX für Kryo-EM und Kristallographie. Acta Crystallogr D. Struktur. Biol. 74, 531–544 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Voss, NR & Gerstein, M. 3V: Rechner und Extraktor für Hohlraum-, Kanal- und Spaltvolumen. Nucleic Acids Res 38, W555–W562 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goddard, TD et al. UCSF ChimeraX: Moderne Herausforderungen in der Visualisierung und Analyse meistern. Proteinwissenschaft. 27, 14–25 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Catherwood, AC et al. Substrat- und stereochemische Kontrolle der Peptidoglycan-Vernetzung durch Transpeptidierung durch Escherichia coli PBP1B. Marmelade. Chem. Soc. 142, 5034–5048 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schägger, H. Tricine–SDS-SEITE. Nat. Protokoll. 1, 16–22 (2006).

Artikel PubMed Google Scholar

Zhao, G., Meier, TI, Kahl, SD, Gee, KR & Blaszczak, LC BOCILLIN FL, ein empfindliches und kommerziell erhältliches Reagenz zum Nachweis von Penicillin-bindenden Proteinen. Antimikrob. Agenten Chemother. 43, 1124–1128 (1999).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Steinegger, M. & Söding, J. MMseqs2 ermöglicht die Suche nach sensiblen Proteinsequenzen für die Analyse umfangreicher Datensätze. Nat. Biotechnologie. 35, 1026–1028 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Crooks, GE, Hon, G., Chandonia, JM & Brenner, SE WebLogo: ein Sequenz-Logo-Generator. Genome Res 14, 1188–1190 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ashkenazy, H. et al. ConSurf 2016: eine verbesserte Methodik zur Schätzung und Visualisierung der evolutionären Erhaltung in Makromolekülen. Nucleic Acids Res 44, W344–W350 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ovchinnikov, S., Kamisetty, H. & Baker, D. Robuste und genaue Vorhersage von Rest-Rest-Wechselwirkungen über Proteinschnittstellen hinweg unter Verwendung evolutionärer Informationen. Elife 3, e02030 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Jeschke, G. et al. DeerAnalysis2006 – ein umfassendes Softwarepaket zur Analyse gepulster ELDOR-Daten. Appl. Magn. Resonanz. 30, 473–498 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Worswick, SG, Spencer, JA, Jeschke, G. & Kuprov, I. Tiefe neuronale Netzwerkverarbeitung von DEER-Daten. Wissenschaft. Adv. 4, eaat5218 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jeschke, G. MMM: Eine Toolbox zur integrativen Strukturmodellierung. Proteinwissenschaft. 27, 76–85 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nivedha, AK, Thieker, DF, Hu, H. & Woods, RJ Vina-Carb: Verbesserung der glykosidischen Winkel während des Kohlenhydrat-Andockens. J. Chem. Theorieberechnung. 12, 892–901 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, S., Pires, MM & Im, W. Einblick in die Elongationsstadien der Peptidoglycan-Verarbeitung in bakteriellen Zytoplasmamembranen. Wissenschaft. Rep. 8, 17704 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

de Jong, DH et al. Verbesserte Parameter für das grobkörnige Martini-Protein-Kraftfeld. J. Chem. Theorieberechnung. 9, 687–697 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Souza, PCT et al. Martini 3: ein Allzweck-Kraftfeld für grobkörnige Molekulardynamik. Nat. Methoden 18, 382–388 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kabsch, W. & Sander, C. Wörterbuch der Proteinsekundärstruktur: Mustererkennung von wasserstoffgebundenen und geometrischen Merkmalen. Biopolymers 22, 2577–2637 (1983).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Oluwole, AO et al. Die Peptidoglycan-Biosynthese wird durch den Lipidtransfer entlang Enzym-Substrat-Affinitätsgradienten vorangetrieben. Nat. Komm. 13, 2278 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alessandri, R. et al. Grobkörniges Kraftfeld Martini 3: Kleine Moleküle. Adv. Simulationstheorie. 5, 2100391 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Hunter, JD Matplotlib: Eine 2D-Grafikumgebung. Berechnen. Wissenschaft. Ing. 9, 90–95 (2007).

Artikel Google Scholar

Nugent, T. & Jones, DT Membranproteinorientierung und -verfeinerung unter Verwendung eines wissensbasierten statistischen Potenzials. BMC Bioinforma. 14, 276 (2013).

Artikel Google Scholar

Wassenaar, TA, Ingolfsson, HI, Bockmann, RA, Tieleman, DP & Marrink, SJ Computational Lipidomics mit Insane: Ein vielseitiges Werkzeug zur Generierung benutzerdefinierter Membranen für molekulare Simulationen. J. Chem. Theory Comput 11, 2144–2155 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Abraham, MJ et al. GROMACS: Hochleistungsmolekulare Simulationen durch mehrstufige Parallelität von Laptops bis zu Supercomputern. SoftwareX 1-2, 19–25 (2015).

Artikel ADS Google Scholar

Bussi, G., Donadio, D. & Parrinello, M. Kanonische Abtastung durch Geschwindigkeitsneuskalierung. J. Chem. Physik. 126, 014101 (2007).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Bernetti, M. & Bussi, G. Druckkontrolle mittels stochastischer Zellneuskalierung. J. Chem. Physik. 153, 114107 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Hess, B., Bekker, H., Berendsen, HJC & Fraaije, JGEM LINCS: Ein linearer Constraint-Löser für molekulare Simulationen. J. Comput. Chem. 18, 1463–1472 (1997).

3.0.CO;2-H" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291096-987X%28199709%2918%3A12%3C1463%3A%3AAID-JCC4%3E3.0.CO%3B2-H" aria-label="Article reference 77" data-doi="10.1002/(SICI)1096-987X(199709)18:123.0.CO;2-H">Artikel CAS Google Scholar

Michaud-Agrawal, N., Denning, EJ, Woolf, TB & Beckstein, O. MDAnalysis: Ein Toolkit für die Analyse von Molekulardynamiksimulationen. J. Comput. Chem. 32, 2319–2327 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tribello, GA, Bonomi, M., Branduardi, D., Camilloni, C. & Bussi, G. PLUMED 2: Neue Federn für einen alten Vogel. Computerphysik. Komm. 185, 604–613 (2014).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Vickery, ON & Stansfeld, PJ CG2AT2: ein verbesserter fragmentbasierter Ansatz für serielle Multiskalen-Molekulardynamiksimulationen. J. Chem. Theorieberechnung. 17, 6472–6482 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, J. & MacKerell, AD Jr. CHARMM36 Allatom-additives Protein-Kraftfeld: Validierung basierend auf Vergleich mit NMR-Daten. J. Comput Chem. 34, 2135–2145 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jorgensen, WL, Chandrasekhar, J., Madura, JD, Impey, RW & Klein, ML Vergleich einfacher Potentialfunktionen zur Simulation von flüssigem Wasser. J. Chem. Physik. 79, 926–935 (1983).

Artikel ADS CAS Google Scholar

MacKerell, AD et al. Empirisches Potenzial aller Atome für molekulare Modellierung und dynamische Studien von Proteinen. J. Phys. Chem. B 102, 3586–3616 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nosé, S. & Klein, ML Molekulardynamik bei konstantem Druck für molekulare Systeme. Mol. Physik. 50, 1055–1076 (1983).

Artikel ADS Google Scholar

Parrinello, M. & Rahman, A. Polymorphe Übergänge in Einkristallen: Eine neue Methode der Molekulardynamik. J. Appl. Physik. 52, 7182–7190 (1981).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Essmann, U. et al. Eine Ewald-Methode mit glattem Partikelnetz. J. Chem. Physik. 103, 8577–8593 (1995).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Martins, A. et al. Selbstassoziation von MreC als regulatorisches Signal bei der Verlängerung der Bakterienzellwand. Nat. Komm. 12, 2987 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Diese Arbeit wurde durch die NIGMS-Zuschüsse R35GM132120 (To FM), R35GM141953 (JD), R35GM131829 (LC) und F32GM136076 (MBD) unterstützt. DIR wurde durch einen Schaefer Research Scholars Program Award an die Columbia University, einen Zuschuss BB/N003241/1 des Biological Sciences Research Council (BBSRC) und einen Zuschuss MR/N002679/1 des Medical Research Council (MRC) finanziert. Die Forschung im PJS-Labor wird von Wellcome (208361/Z/17/Z), dem MRC (MR/S009213/1) und dem BBSRC (BB/P01948X/1, BB/R002517/1 und BB/S003339/1) finanziert. Das Stipendium für JJD wurde vom MRC (MR/N014294/1) gesponsert, und das Stipendium für NSB und CLBG wurde vom BBSRC (BB/M01116X/1) gesponsert. CLBG erhielt außerdem Mittel aus dem NERC-Zuschuss NE/T014717/1 und der Antibiotic Research UK Charity. Das CMB-Studium wird vom MRC (MR/N014294/1) gesponsert. Dieses Projekt nutzte die Zeit für ARCHER und JADE, die vom britischen High-End Computing Consortium for Biomolecular Simulation, HECBioSim (http://hecbiosim.ac.uk), bereitgestellt und von EPSRC (Fördernummer EP/R029407/1) unterstützt wurde. PJS dankt Sulis bei HPC Midlands +, das vom EPSRC mit dem Zuschuss EP/T022108/1 finanziert wurde, und der University of Warwick Scientific Computing Research Technology Platform für den Computerzugang.

Abteilung für Physiologie und Zellbiophysik, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, 10032, USA

Rie Nygaard, Joseph Pepe, Silvia Corradi, Khuram U. Ashraf, Oliver B. Clarke und Filippo Mancia

School of Life Sciences, University of Warwick, Coventry, CV4 7AL, Großbritannien

Chris LB Graham, Jonathan D. Colburn, Chelsea M. Brown, Owen N. Vickery, Nicholas S. Briggs, John J. Deering, Phillip J. Stansfeld und David I. Roper

Abteilung für Chemie und Abteilung für Molekulare Physiologie und biologische Physik, University of Virginia, Charlottesville, VA, 22904, USA

Meagan Belcher Dufrisne und Linda Columbus

Fachbereich Chemie, University of Warwick, Coventry, CV4 7AL, Großbritannien

Jonathan D. Colburn, Chelsea M. Brown, Owen N. Vickery und Phillip J. Stansfeld

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, 10032, USA

Molly A. Hydorn und Jonathan Dworkin

Fakultät für Pharmazie und Medizin, Universität La Sapienza Rom, Rom, Italien

Silvia Corradi & Bruno Botta

New York Consortium on Membrane Protein Structure, New York Structural Biology Center, 89 Convent Avenue, New York, NY, 10027, USA

Brian Kloss

Abteilung für Anästhesiologie, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, 10032, USA

Oliver B. Clarke

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Das SEDS-PBP-Fusionsdesign und die Klonierung wurden von MBD mit Hilfe von JD durchgeführt und BKRN optimierte die Expression des E. coli-RodA-PBP2-Konstrukts mit Hilfe von KA-, SC- und MBDRN-gereinigtem Protein für Kryo-EM-Proben. RN sammelte und analysierte die Kryo-EM-Daten. RN erstellte das Modell mit Hilfe von CLBG und OBC. Die Genbearbeitung für E. coli-Funktionstests wurde von CLBG durchgeführt und JP, CLBG und NB führten die Proteinexpression und -reinigung für E. coli-Funktionstests durch. Funktionelle In-vitro-Lipid-II-Polymerisationstests in E. coli wurden von CLBG durchgeführt. Die Genbearbeitung für B. subtilis wurde von MAH und JD durchgeführt. In vivo-B. subtilis-Sporulationstests wurden vom MAH unter Aufsicht von JD durchgeführt. Alle MD-Simulationen wurden von PJS durchgeführt und JDC, einige Skripte wurden von OV bereitgestellt, Parameter für die Lipid-II-Dynamik wurden von CMB entworfen. Autodock. Lipid-II-Bindungsexperimente wurden von CMB und CLBG durchgeführt. Das Lipid-II-Substrat wurde von CLBG und JJD synthetisiert. Die Koevolutionsanalyse wurde von PJS und CLBG durchgeführt Die Genbearbeitung für DEER-Experimente wurde von MBD und CLBG durchgeführt, und DEER-Daten wurden von MBD unter Aufsicht der von LCRN, CLBG, MBD, BB, JDC, PJS, LC, JD, FM und DIR entworfenen Experimente und RN, CLBG, MBD, JDC, PJS, LC, JD, FM und DIR haben den Artikel geschrieben. Die Aufsicht über das gesamte Projekt wurde von FM übernommen

Korrespondenz mit Linda Columbus, Jonathan Dworkin, Phillip J. Stansfeld, David I. Roper oder Filippo Mancia.

Die Autoren erklären kein konkurrierendes Interesse.

Nature Communications dankt Konstantinos Beis und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Nygaard, R., Graham, CLB, Belcher Dufrisne, M. et al. Strukturelle Grundlagen der Peptidoglycan-Synthese durch den RodA-PBP2-Komplex von E. coli. Nat Commun 14, 5151 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40483-8

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Eingegangen: 11. November 2022

Angenommen: 31. Juli 2023

Veröffentlicht: 24. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40483-8

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