Forschung der Universität Kanazawa: Forscher definieren ein Nanopipetten-Herstellungsprotokoll für die hochauflösende Zellbildgebung

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22. August 2023, 04:03 Uhr ET

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KANAZAWA, Japan, 22. August 2023 /PRNewswire/ -- Forscher der Universität Kanazawa berichten in analytischer Chemie, wie man Nanopipetten herstellen kann, die zuverlässig Rasterionenleitfähigkeitsmikroskopiebilder lebender Zellen mit Nanometerauflösung liefern.

Eine nanoskalige Betrachtung lebender Zellen kann wertvolle Einblicke in die Zellstruktur und -funktion liefern. Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Mikroskopietechniken eingesetzt, um einen Einblick in biologische Proben im Nanomaßstab zu erhalten, doch alle hatten ihre Grenzen und Herausforderungen. Obwohl die Rasterionenleitfähigkeitsmikroskopie (SICM) die Fähigkeit bewiesen hat, lebende biologische Proben in Lösung mit nanoskaliger Auflösung abzubilden, wurde sie durch Herausforderungen bei der zuverlässigen Herstellung von Nanopipetten mit der optimalen Geometrie für die Aufgabe behindert. Jetzt haben Forscher unter der Leitung von Yasufumi Takahashi am Nano LSI der Universität Kanazawa und der Universität Nagoya ein Protokoll zur reproduzierbaren Herstellung von Nanopipetten mit der bevorzugten Geometrie für hochwertige Bildgebung entwickelt. Bei der Rasterionenleitfähigkeitsmikroskopie (SICM) wird eine Nanopipette verwendet, um den Abstand zwischen Nanopipette und Proben mithilfe eines Ionenstroms als Rückkopplungssignal zu steuern. Die Form der Nanopipette beeinflusst maßgeblich die Leistung des Geräts. Beispielsweise schränkt eine große Apertur die mögliche Auflösung ein, ein langer Shunt kann zu Gleichrichtungseffekten führen, die die Ionenstrommessungen verzerren, und wenn das Glas der Nanopipette zu dick ist, kann es die Probe verformen, bevor die Nähe der Apertur erreicht ist Punkt, der für die topografische Kartierung mit konstantem Ionenstrom benötigt wird. Daher verfügt die ideale Nanopipette über einen kurzen Shunt, eine kleine Öffnung und dünne Glaswände.

Das Standardverfahren zur Herstellung der Nanopipette besteht darin, ein Kapillarröhrchen mit einem Laserzieher zu ziehen, der das Kapillarröhrchen, das man manipuliert, erhitzt. Die Kapillare verengt sich dann, wo sie länger wird, bis sie schließlich in zwei separate Teile zerlegt wird. Obwohl Quarz eine etwas bessere Kontrolle über den Prozess des Formens des Kapillarröhrchens ermöglicht, ist er hydrophob, was zu Komplikationen beim tatsächlichen Befüllen der Nanopipette mit der für den Ionenstrom erforderlichen wässrigen Lösung führt. Aus diesem Grund entwickelten die Forscher ein Protokoll, mit dem sie mit der erforderlichen Kontrolle und Reproduzierbarkeit Nanopipetten aus Borosilikatglaskapillaren entnehmen konnten.

Takahashi und seine Mitarbeiter stellten fest, dass die Ausgangskapillare idealerweise dicke Wände und einen schmalen Innendurchmesser haben sollte, es ist jedoch nicht einfach, von kommerziellen Anbietern Kapillarröhrchen zu erhalten, die diesen Anforderungen entsprechen. Stattdessen heizen sie die Kapillare 5 Sekunden lang vor, ohne daran zu ziehen, was zu einer Verdickung der Glaswände und einer Verringerung des Innendurchmessers führt. Sie optimierten auch die Parameter zum Ziehen des Rohrs, beispielsweise die Geschwindigkeit.

Die Forscher demonstrierten die Leistung der von ihnen hergestellten Nanopipetten, indem sie eine Zelle abbildeten, die eine Art Endozytose durchläuft, bei der sie äußeres Material verschlingt und absorbiert. Sie konnten die Mikrovilli – Zellmembranvorsprünge – auf der Zelloberfläche, die sich bildenden Endozytärgruben und die Bildung einer Kappe, die die Grube verschließt, abbilden. Bisherige Versuche, die Kappenbildung abzubilden, wurden durch Einschränkungen der räumlichen Auflösung behindert.

Den Forschern gelang es sogar, dabei freigesetzte extrazelluläre Vesikel mit einer Größe von nur 189 nm aufzulösen. Wie sie in ihrem Bericht hervorheben, gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass diese extrazellulären Vesikel eine wichtige Rolle bei der Kommunikation zwischen Zellen und der Homöostase spielen, wobei sich diagnostische und therapeutische Anwendungen insbesondere auf die kleineren extrazellulären Vesikel zwischen 40 nm und 150 nm konzentrieren. Die Forscher kommen in ihrem Bericht zu dem Schluss: „Wir gehen davon aus, dass dieses Protokoll dazu beitragen wird, Borosilikat-Nanopipetten für die hochauflösende topografische Kartierung mithilfe von SICM reproduzierbar herzustellen.“

Bildlink https://nanolsi.kanazawa-u.ac.jp/wp/wp-content/uploads/fig1-6.jpg© 2023 American Chemical Society

Bildunterschrift: Abb. 1. Neue Methode zur Herstellung einer Nanopipette und hochauflösende Abbildung ihrer Form. Oben links: Glaskapillare nach dem Vorheizen zur Glasverformung. Unten links: Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Nanopipettenspitze; Rechts: SICM-Bild der Oberfläche einer fixierten HeLa-Zelle.

Glossar

Rasterionenleitfähigkeitsmikroskopie

Das Grundprinzip der Raster-Ionen-Leitfähigkeitsmikroskopie (SICM) beruht auf der Überwachung des Ionenstroms, der durch eine Nanopipette fließt, die eine Art Elektrolyt enthält. Es kann die Topographie einer Probe abbilden, indem es die Höhe der Nanopipette anpasst, um einen konstanten Ionenstrom aufrechtzuerhalten, während sie über die Probenoberfläche gescannt wird. Die Nähe zur Probenoberfläche hat einen messbaren Einfluss auf den Ionenfluss und damit auf den Strom, bevor die Spitze mit der Probe in Kontakt kommt, was sie für biologische Proben nützlich macht, die leicht beschädigt werden könnten. Es funktioniert auch gut in Lösung, wohingegen Techniken wie die Elektronenmikroskopie eine Fixierung der Probe erfordern.

SICM wurde im Hopping-Modus verwendet, bei dem sich die Pipette der Probe nähert und wieder zurückzieht, wodurch das Risiko einer Probenbeschädigung weiter verringert wird, insbesondere wenn die Probenoberfläche nicht flach ist. Allerdings dauert es aufgrund der vertikalen Distanzen, die die Nanopipette zurücklegt, länger und es kann zu mehr Lärm kommen. In diesem Bericht zeigten die Autoren, dass ihre Hochleistungs-Nanopipetten die Notwendigkeit von Hopping-Mode-Messungen für ihre Proben überflüssig machten.

Extrazelluläres Vesikel

Dies sind Partikel, die durch eine Lipiddoppelschicht gebunden sind, die alle Zellen produzieren, obwohl sie sich im Gegensatz zu einer Zelle nicht selbst vermehren. In jüngster Zeit ist das Interesse an ihnen stark gestiegen, da Studien ihre wahrscheinliche Rolle bei der Übertragung von Signalen aufgedeckt haben, was dazu geführt hat, dass sie als „neuartiges krines System“ beschrieben werden, in Analogie zum endokrinen System, das Hormone absondert, um Signale im Körper zu senden .

ReferenzYasufumi Takahashi, Yuya Sasaki, Takeshi Yoshida, Honda Kota, Yuanshu Zhou, Takafumi Miyamoto, Tomoko Motoo, Hiroki Higashi, Andrew Shevchuk, Yuri Korchev, Hiroki Ida, Rikinari Hanayama, Takeshi Fukuma. Richtlinien zur Herstellung von Nanopipetten für SICM Nanoscale Imaging, Analytische Chemie August 20, 2023.DOI:10.1021/acs.analchem.3c01010URL: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c01010

KontaktHiroe YonedaSenior Specialist in Project Planning and OutreachNanoLSI Administrative OfficeWPI Nano Life Science Institute (WPI-NanoLSI)Kanazawa UniversityKakuma-machi, Kanazawa 920-1192, JapanE-Mail: [email protected]Tel: +81 (76) 234-4550

Über das Nano Life Science Institute (WPI-NanoLSI)

Das Nano Life Science Institute (NanoLSI) der Universität Kanazawa ist ein Forschungszentrum, das 2017 im Rahmen der World Premier International Research Center Initiative des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie gegründet wurde. Ziel dieser Initiative ist die Bildung von Forschungszentren auf Weltniveau. NanoLSI kombiniert das führende Wissen der Bio-Scanning-Sondenmikroskopie, um „nanoendoskopische Techniken“ zu etablieren, mit denen Biomoleküle direkt abgebildet, analysiert und manipuliert werden können, um Einblicke in Mechanismen zu erhalten, die Lebensphänomene wie Krankheiten steuern.

https://nanolsi.kanazawa-u.ac.jp/en/

Über die Universität Kanazawa

Als führende Gesamtuniversität an der Küste des Japanischen Meeres hat die Universität Kanazawa seit ihrer Gründung im Jahr 1949 einen großen Beitrag zur Hochschulbildung und akademischen Forschung in Japan geleistet. Die Universität verfügt über drei Colleges und 17 Schulen, die Kurse in Fächern wie Medizin und Computertechnik anbieten und Geisteswissenschaften.

Die Universität liegt an der Küste des Japanischen Meeres in Kanazawa – einer Stadt reich an Geschichte und Kultur. Die Stadt Kanazawa verfügt seit der Zeit des Lehens (1598–1867) über ein hochgeschätztes intellektuelles Profil. Die Kanazawa-Universität ist in zwei Hauptcampusse unterteilt: Kakuma und Takaramachi für ihre rund 10.200 Studenten, darunter 600 aus dem Ausland.

http://www.kanazawa-u.ac.jp/e/

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