Eine Drei

npj Biofilms and Microbiomes Band 9, Artikelnummer: 57 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Fülle an Stressfaktoren, die mikrobielle Zellen schädigen können, hat ausgefeilte Stressreaktionsmechanismen entwickelt. Während vorhandene Bioreporter individuelle Reaktionen überwachen können, fehlen noch Sensoren zur Erkennung multimodaler Stressreaktionen in lebenden Mikroorganismen. Orthogonal nachweisbare rote, grüne und blaue fluoreszierende Proteine, kombiniert in einem einzigen Plasmid, dem sogenannten RGB-S-Reporter, ermöglichen eine gleichzeitige, unabhängige Echtzeitanalyse der Transkriptionsreaktion von Escherichia coli mithilfe von drei Promotoren, die physiologischen Stress melden (PosmY für RpoS). ), Genotoxizität (PsulA für SOS) und Zytotoxizität (PgrpE für RpoH). Der Bioreporter ist mit der Standardanalyse und der Fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) in Kombination mit anschließender Transkriptomanalyse kompatibel. Verschiedene Stressfaktoren, darunter das biotechnologisch relevante 2-Propanol, aktivieren eine, zwei oder alle drei Stressreaktionen, die nicht stressbedingte Stoffwechselwege erheblich beeinflussen können. Der RGB-S-Reporter wurde in die mikrofluidische Kultivierung mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung implementiert und ermöglichte die räumlich-zeitliche Analyse lebender Biofilme, die geschichtete Subpopulationen von Bakterien mit heterogenen Stressreaktionen aufdeckte.

Um zu verstehen, wie Mikroorganismen adaptive Veränderungen vermitteln, um das Überleben unter sich ändernden Umweltbedingungen zu sichern, ist die Überwachung der entsprechenden Stressreaktionswege erforderlich. RpoS, SOS und RpoH sind kritische Stressreaktionswege, die Transkriptionswege durch ein breites Spektrum von Stressreizen modulieren, mit Auswirkungen auf die Bildung und Verbreitung von Biofilmen1,2, die Virulenz von Krankheitserregern3, die Antibiotikaresistenz4, die Evolution4 und den ökologischen Wettbewerb5. RpoS ist ein alternativer Sigma-Faktor, der direkt und indirekt etwa 500 Gene in Escherichia coli (E. coli)6 reguliert. Die als allgemeine Stressreaktion bekannte RpoS-Aktivierung wird hauptsächlich durch Hungern als Indikator für physiologischen Stress stimuliert7. Die SOS-Reaktion hingegen umfasst mehr als 50 Gene, die verschiedene Funktionen als Reaktion auf DNA-Schäden erfüllen, die durch chemische, physikalische oder biologische Einwirkungen verursacht werden8. Daher ist die Hochregulierung der SOS-Reaktion mit der Genotoxizität der Zellen verbunden. Der alternative Sigma-Faktor RpoH ist der Schlüsselregulator der Hitzeschock-Stressreaktion in E. coli, der mehr als 30 Gene umfasst9,10. Die Aktivierung der RpoH-Reaktion wird durch die Akkumulation ungefalteter Proteine in der Zelle als Hinweis auf Zytotoxizität stimuliert.

Angesichts der hohen Relevanz dieser biologischen Prozesse für Technik und Medizin ist ein umfassendes Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen von herausragender Bedeutung. Beispielsweise kann die Überwachung zellulärer Reaktionen auf mehrere Stressfaktoren einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Lebensfähigkeit und Produktivität der Zellen11 leisten, beispielsweise Produkthemmung, Nährstoffmangel, pH-Wert oder Scherstress12, sowie zur Überwachung einer Vielzahl von Umweltgiften wie Herbiziden oder Antibiotika13. Eine multimodale Analyse der mikrobiellen Stressreaktion wäre daher nicht nur für die Grundlagenforschung, sondern auch für biotechnologische Prozesse wichtig.

Um dieses Ziel zu erreichen, wurden mehrere genetisch kodierte bakterielle Biosensoren entwickelt12,13,14,15,16,17,18. Häufig verwendete Reporterelemente sind die kolorimetrischen β-Galactosidase- (lacZ)15 und Biolumineszenz-Reporter (luc, lux)16. Da diese Systeme in der Regel eine Zelllyse, mehrstufige Tests oder katalytische Reaktionen erfordern, die die Online-Messung und die mehrfarbige Berichterstattung einschränken, wurden fluoreszenzbasierte Reporter für die Analyse der Stressreaktion entwickelt17,18. Den derzeit verfügbaren Systemen fehlt jedoch die Fähigkeit, die multimodale Reaktion lebender Zellen mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung zu melden. Wir beschreiben hier einen genetisch kodierten Dreifarben-Fluoreszenz-Biosensor, der gleichzeitig die bakterielle Reaktion auf physiologischen Stress, Genotoxizität und Zytotoxizität anzeigt, indem er die entsprechenden Stressreaktionswege überwacht (Abb. 1 und ergänzende Abb. 1).

Die Aktivierung der Stressreaktionswege RpoS, SOS und RpoH führt zur Expression rot, grün bzw. blau fluoreszierender Proteine, wie durch Fluoreszenzmikroskopiebilder gezeigt. Der Maßstabsbalken beträgt 50 µm.

Um einen robusten mehrfarbigen Stressreaktionsreporter mit hohen Signal-Rausch-Verhältnissen zu realisieren, wurden drei Promotoren des Modellorganismus E. coli K12 MG1566 ausgewählt: PsulA ist ein stark induzierter Promotor während der SOS-Reaktion, der auf DNA-Schäden (Genotoxizität) hinweist. 19 und PosmY aus dem RpoS-Regulon ist ein Indikator für Nährstoffmangel, osmotische und andere physiologische Belastungen20. Der Chaperon-Promotor PgrpE ist an der Hitzeschock-RpoH-Reaktion beteiligt, die durch die intrazelluläre Ansammlung entfalteter Proteine aktiviert wird, die auf Zytotoxizität hinweisen16,21. Drei orthogonal nachweisbare Varianten des fluoreszierenden Proteins (FP) mit den Farben Rot (mRFP1)22, Grün (GFPmut3b)23 und Blau (mTagBFP2)24 wurden ausgewählt, um das gleichzeitige Auslesen der Signalwegaktivierung zu ermöglichen (Ergänzungstabelle 1). Die kodierenden Sequenzen für die drei FPs wurden für hohe Proteintranslationsraten25 in E. coli optimiert, um auch unter Bedingungen der Wachstumshemmung ausreichende Signale sicherzustellen. Da die FP-Synthese und -Reifung eine wichtige Rolle bei der Initiierung des Fluoreszenzsignals26 spielt, haben wir die verstärkten Fluoreszenzproteine GFPmut3b23 und mRFP122 verwendet, die schneller reifen als die nativen Vorfahren. Durch die Fusion der FPs stromabwärts der Promotoren enthielt der vollständig zusammengesetzte RGB-S-Reporter (für roten, grünen, blauen Stressreporter) die genetischen Elemente von PosmY::mRFP1 zur Anzeige von physiologischem Stress, PsulA::GFPmut3b für Genotoxizität und PgrpE: :mTagBFP2 für Zytotoxizität (Ergänzende Abbildung 1). Um Artefakte beim translatorischen Durchlesen eines Reporterelements auf die anderen zu verhindern, wurden zwischen den Sensorelementen strenge Transkriptionsterminatoren hinzugefügt, was zu einer individuell ausgelösten Reaktion der isolierten Sensorelemente führte (ergänzende Abbildung 1). Die Tribble-Biosensor-Kassetten wurden in ein Multi-Copy-Plasmid-Rückgrat kloniert und durch Kanamycin-Selektion aufrechterhalten.

Um zunächst die Spezifität und Robustheit des RGB-S-Reporters sowohl bei der Mikroskopieanalyse als auch bei quantitativen Massenmessungen zu überprüfen, wurde seine Leistung mit zuvor veröffentlichten Systemen verglichen. Zu diesem Zweck wurden mit dem RGB-S-Reporter transformierte E. coli dem Herbizid Glyphosat ausgesetzt. Wie erwartet kam es zu einer Hochregulierung der Hungerreaktion27, die zu einer erheblichen Expression von rot fluoreszierendem Protein (RFP) führte (Abb. 2a). Ebenso löste das Vorhandensein des Antibiotikums Nalidixinsäure (NA), das in die DNA-Gyrase eingreift, die DNA-Wiedergabetreue beeinträchtigt und die SOS-Reaktion auslöst28, die erwartete Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) aus. Insbesondere ermöglichte die Fluoreszenzbildgebung auch die Identifizierung einzigartiger Zellmorphologien, wie beispielsweise der Zellfilamentierung. Dieser Phänotyp ist charakteristisch für die SOS-Reaktion im Spätstadium und war im GFP-Kanal von Zellen, die NA (Abb. 2a) oder Ciprofloxacin (ergänzende Abb. 2) ausgesetzt waren, deutlich sichtbar. Die Behandlung der Zellen mit Methanol, von dem bekannt ist, dass es neben anderen zytotoxischen Wirkungsweisen auch die Membranpermeabilität beeinflusst30, führte zur Induktion eines signifikanten Signals des blau fluoreszierenden Proteins (BFP) (Abb. 2a). Die bei BFP beobachtete Faltungsänderung ist jedoch geringer als bei den anderen beiden fluoreszierenden Proteinen, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass die vom Sensor angezeigte Zytotoxizität Fehlfaltungsereignisse meldet, die sich auch auf das BFP selbst auswirken könnten. Zusätzlich zur mikroskopischen Analyse könnte die Reaktion des RGB-S-Reporters auf Belastungen auch in Massenkulturen überwacht werden, um eine detaillierte quantitative Bewertung der Kinetik und Dosisabhängigkeit der Arzneimittelbehandlung zu ermöglichen (Abb. 2b und ergänzende Abb. 3). Die Behandlung von E. coli mit RGB-S-Reporter (RGB-S E. coli) mit definierten Dosierungen von Stressoren zeigte deutlich den erwarteten dosisabhängigen Anstieg des entsprechenden Fluoreszenzsignals im Laufe der Zeit. Bemerkenswert ist, dass die genauesten Ergebnisse für die meisten Stressfaktoren während der ersten fünf Stunden erzielt werden können, während die Zellen aktiv wachsen. Danach können aufgrund akkumulierter und störender Stresssignale in alternden Zellen stochastische Messwerte beobachtet werden (ergänzende Abbildung 4). Darüber hinaus haben wir die Plasmidstabilität in Gegenwart und Abwesenheit einer Kanamycin-Selektion während längerer Stresstests überprüft. Wir fanden heraus, dass das Fehlen einer Kanamycin-Selektion keinen Einfluss auf die Stabilität des RGB-S-Reporterplasmids in alternden und verdünnten Kulturen hatte (ergänzende Abbildung 5). In der verdünnten Kultur wurde jedoch ein allgemeiner Rückgang des spezifischen Fluoreszenzsignals beobachtet, was auf einen möglichen Rückgang der Plasmidkopienzahl aufgrund der kontinuierlichen Zellteilung hinweist (ergänzende Abbildung 5c, d).

a Fluoreszenzmikroskopische Bilder von planktonischen E. coli, die RGB-S-Reporter beherbergen und 5 Stunden lang verschiedenen Stressfaktoren ausgesetzt waren. Der Maßstabsbalken beträgt 50 µm. b Die entsprechenden quantitativen Mikrotiterplatten-Messwerte, dargestellt als Balken, geben die fache Änderung (FC) der spezifischen Fluoreszenz (FU/OD600) gegenüber Kontrollen an, die den Sensor trugen, aber keinem Stressor ausgesetzt waren. Fehlerbalken sind die Standardabweichung (SD) von sechs biologischen Replikaten. (*) Test und Kontrolle zeigen einen signifikanten Unterschied (p ≤ 0,05), bewertet durch Independent Samples T-Test. c Zeitverlaufsmessungen der spezifischen roten, grünen und blauen Fluoreszenzreaktion auf Glyphosat (RFP), Nalidixinsäure (GFP) bzw. Methanol (BFP) veranschaulichen die Abhängigkeit der Stressreaktion von der Stressordosis und der Expositionszeit. RFU, GFU und BFU beziehen sich auf rote, grüne bzw. blaue Fluoreszenzeinheiten. Fehlerbalken sind die Standardabweichung (SD) von sechs biologischen Replikaten. Beachten Sie, dass die Hauptreaktionen, die durch mikroskopische Bildgebung in a beobachtet wurden, eindeutig mit den quantitativen Auswertungen durch Plattenlesegeräte in b und c korrelieren.

Darüber hinaus enthüllte der RGB-S-Reporter zelluläre Reaktionen in Echtzeit. Beispielsweise ist der durch NA verursachte DNA-Schaden kumulativ, da das Medium kontinuierlich NA ausgesetzt ist, was zu einem exponentiellen Anstieg des GFP-Signals im Laufe der Zeit führt (Abb. 2b). Im Gegensatz dazu führte eine kurze Stimulation durch UV-Bestrahlung zu einem Anstieg des GFP-Signals (SOS-Antwort aufgrund einer DNA-Schädigung), das 45–75 Minuten nach der Stimulation seinen Höhepunkt erreichte, gefolgt von einem Signalabfall, der wahrscheinlich auf die Reparatur des Schadens oder die Signalverdünnung zurückzuführen ist durch Zellwachstum (Ergänzende Abb. 3b). Solche detaillierten Analysen der Wirkmechanismen zelltoxischer Substanzen sind mit herkömmlichen Sensoransätzen nur schwer zu erreichen.

Die Fähigkeit, Reaktionen in Echtzeit zu beobachten, zeigte Variationen in der Signalinitiierung aufgrund unterschiedlicher Regulon-Aktivierung beim Einsatz variabler Stressfaktoren. Beispielsweise fanden wir heraus, dass Zellen, die Glyphosat ausgesetzt waren, innerhalb von 15 Minuten durch RFP-Fluoreszenz reagierten, wohingegen die Exposition gegenüber Natriumdodecylsulfat (SDS) erst nach einer Verzögerungszeit von 4 Stunden zu ähnlichen Signalintensitäten führte (ergänzende Abbildung 6).

Anschließend verwendeten wir RGB-S E. coli zum direkten Vergleich mono- und multimodaler Effekte verschiedener Stressoren, die quantitativ mit einem Fluoreszenzplattenlesegerät (Abb. 3a und ergänzende Abb. 7) und qualitativ mit Fluoreszenzmikroskopie (Abb. 3b, c und) gemessen wurden Ergänzende Abbildung 2). Wir fanden heraus, dass der RGB-S-Reporter die wichtigsten Wirkungsweisen korrekt identifizierte, die zuvor auf andere Weise bestimmt worden waren (Abb. 3a)16,19,27,28,31,32,33,34,35,36. Beispielsweise induzierten einige Antibiotika und UV-Bestrahlung hochspezifisch die GFP-Fluoreszenz und korrelierten somit mit ihrem genotoxischen Potenzial aufgrund von DNA-Schäden (Abb. 3a)19,28,31. Glyphosat zeigte auch eine hochspezifische Veränderung der RFP (RpoS)-Expression aufgrund seiner Hemmung des Shikimat-Signalwegs über die 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase und störte so viele Stoffwechselwege27.

eine multimodale Reaktion von RGB-S E. coli auf Stressinduktoren, dargestellt als Fold Changes (FC) des Fluoreszenzsignals im Vergleich zu nicht gestressten Kontrollen. Fehlerbalken sind die Standardabweichung (SD) von sechs biologischen Replikaten. (*) Test und Kontrolle zeigen einen signifikanten Unterschied (p ≤ 0,05), bewertet mit dem T-Test von Independent Samples für normale Mittelwerte und dem Mann-Whitney-U-Test für nicht normale Mittelwerte. Für Hunger wurde die Signifikanz durch den Paired Sample T-Test bestimmt. Kulturen, die das Reporterplasmid enthielten, wurden 5 Stunden lang in Luria-Bertani-Medium, ergänzt mit Kanamycin (LB+kan), inkubiert, mit Ausnahme des Fastens, das über 9 Tage durchgeführt wurde. b Analyse der heterogenen Reaktion auf Einzelzellebene auf 2 % (v/v) 2-Propanol, bestimmt durch Mikroskopieanalyse nach 5-stündiger Inkubation. Der Maßstabsbalken beträgt 25 µm. c Repräsentative Bilder (erhalten aus b), die Zellen zeigen, die eine einzelne, multimodale oder keine Stressreaktion zeigen. Der Maßstabsbalken beträgt 5 µm. Rote, grüne und blaue Farben zeigen physiologischen Stress, Genotoxizität bzw. Zytotoxizität an.

Zusätzlich zur korrekten Identifizierung des bekannten Hauptreaktionsregulons lieferte der RGB-S-Reporter Einblicke in die molekularen Mechanismen, die durch Stressoren ausgelöst werden, die mehr als ein Reaktionsregulon induzieren. Beispielsweise wurde im Hungerfall eine bimodale Reaktion von RFP und GFP beobachtet (Abb. 3a). Während die RFP-Fluoreszenz aufgrund der bekannten RpoS-Induktion beim Hungern erwartet wurde33, kann die damit verbundene 3,5-fache GFP (SOS)-Reaktion auf Mutagenese in der stationären Phase zurückgeführt werden37. Darüber hinaus beobachteten wir als allgemeinen Trend eine dreifach modale Reaktion für Verbindungen, die BFP (Zytotoxizität) induzieren, wie Ethanol, 2-Propanol oder Aceton (Abb. 3a und ergänzende Abb. 7). Die BFP-Expression weist auf die Anhäufung fehlgefalteter Proteine hin, die wiederum lebenswichtige Funktionen zellulärer Komponenten beeinträchtigen können. Dies erklärt, warum RFP- und GFP-Signale normalerweise mit der BFP-Antwort verbunden sind. Andererseits wurde die umgekehrte Korrelation nicht beobachtet.

Die multimodale Reaktionsfähigkeit des RGB-S-Reporters wurde dann für eine detaillierte Analyse auf Einzelzellebene mithilfe einer mikroskopischen Bildanalyse genutzt (Abb. 3b, c), aus der das relative Ausmaß jeder Reaktion effizient abgeleitet werden kann (ergänzende Abb. 8). ). Es wurde festgestellt, dass die Multimodalität auf heterogenen Reaktionen von Subpopulationen beruht, die auf einen bestimmten Stressor auf deutlich unterschiedliche Weise reagieren. Beispielsweise könnten Zellen nach Zugabe von 2-Propanol vier Kategorien zugeordnet werden, die entweder eine Mono-, Dual-, Dreifach- oder keine Stressreaktion zeigen (Abb. 3c). Zellen ohne Stressreaktion könnten entweder tote Zellen sein, die also die Transkription eingestellt haben, oder Zellen, die das Sensorplasmid verloren haben. Ähnliche heterogene Ergebnisse wurden bei anderen Stressfaktoren wie Phenol und Butanol erzielt (ergänzende Abbildung 9). Während phänotypische Heterogenität ein gut beschriebenes Phänomen ist, das auf zellinhärente Dynamik, transkriptionelle stochastische Effekte und andere ökologische Faktoren zurückzuführen ist, bleibt die detaillierte Analyse dieser Prozesse schwierig. In diesem Zusammenhang kann der RGB-S-Reporter die molekularen Grundlagen solcher Phänomene aufklären, indem er die Identifizierung und Trennung einzelner Subpopulationen mithilfe etablierter Technologien wie der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) ermöglicht.

Um diesen Ansatz zu demonstrieren, haben wir etwa 1 Million RGB-S-E. coli-Zellen, die mit 2-Propanol 2 % (v/v) behandelt wurden, in zwei Replikaten basierend auf den Einzelzellreaktionen in vier Subpopulationen (Mono-RFP, Mono-GFP, Dual) sortiert RFP-GFP und dreifaches RFP-GFP-BFP) unter Verwendung von FACS (ergänzende Abbildung 10). Eine transkriptomische Analyse wurde durchgeführt, um relative Veränderungen der mRNA-Spiegel zu bestimmen (Abb. 4 und ergänzende Abb. 11). Wie erwartet zeigten die Mono- und Dual-Reaktionen eine Hochregulierung ihrer jeweiligen Stressregulone. In Subpopulationen mit Mono-GFP-Reaktion war die Transkription von SOS-Genen hochreguliert, einschließlich der Gene recA und lexA, die als die wichtigsten SOS-Regulatoren bekannt sind (Abb. 4a). Ebenso zeigte das von RpoS gemeldete Gen osmY sowohl in der Mono-RFP- als auch in der Dual-RFP-GFP-Subpopulation eine vorherrschende Transkription (Abb. 4b). In den dualen RFP-GFP-Subpopulationen zeigten sowohl das SOS-berichtete Gen sulA als auch das Regulatorgen lexA hohe Transkriptionsniveaus. Diese Ergebnisse bestätigten die phänotypische Analyse des RGB-S-Reporters.

RGB-S E. coli-Zellen wurden mit 2 % (v/v) 2-Propanol behandelt und mithilfe von FACS sortiert. Die Populationen wurden basierend auf den individuellen Zellreaktionen in vier Subpopulationen sortiert: Mono-GFP, Mono-RFP, Dual-RFP-GFP und Triple-RFP-GFP-BFP, wobei die Zahlen (1, 2) Replikate angeben. Innerhalb der vier sortierten Subpopulationen wurden differenziell transkribierte Gene analysiert, die an den Stressreaktionswegen SOS (a), RpoS (b) und RpoH (c) beteiligt sind. d Analyse der unterschiedlich transkribierten Stoffwechselwege, wie in der KEGG-Datenbank der vier sortierten Subpopulationen annotiert.

Unerwarteterweise zeigten die RFP-GFP-BFP-Subpopulationen jedoch eine Herunterregulierung der Transkription des von RpoH gemeldeten Gens grpE sowie von Genen, die an SOS- und RpoS-Reaktionen beteiligt sind (Abb. 4c). Die Zellen in dieser Population haben alle drei in dieser Studie analysierten Stressreaktionen aktiviert und mit der Akkumulation aller drei fluoreszierenden Reporterproteine begonnen. Der starke Stress, der durch die Aktivierung mehrerer Signalwege hervorgerufen wird, könnte jedoch dazu führen, dass die Zellen die Transkription stoppen. Solche Zellen würden dann immer noch eine signifikante Fluoreszenz für alle drei Reporter zeigen, aber insgesamt verringerte Transkriptionsniveaus, was letztendlich dazu führen würde, dass die Zellteilung gestoppt und somit unverdünnte fluoreszierende Proteine vorhanden wären. Diese Hypothese wird durch das niedrige Transkriptionsprofil des RpoH-Regulons gestützt, das in den Triple-Response-Zellen beobachtet wurde (ergänzende Abbildung 11). Die Ergebnisse legen nahe, dass eingehendere zeit- und dosisabhängige Studien solcher Subpopulationen erforderlich sind, um das detaillierte Transkriptionsprofil des RpoH-Regulons gegenüber Stressoren aufzuklären.

Interessanterweise ergab die Transkriptomanalyse der sortierten Subpopulationen neben den Signalwegen der Stressreaktion auch andere durch den Stressor veränderte Transkriptionsprofile, wie insbesondere die Anreicherungsanalyse der Stoffwechselwege der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)40 zeigte (Abb. 4d). Beispielsweise wurde gezeigt, dass die Lipopolysaccharid-Biosynthese sowie der Purin- und Pyruvat-Metabolismus in den auf Mono-GFP reagierenden Populationen hochreguliert waren, während der Fructose-, Alanin- und Cystein-Metabolismus in den dualen RFP-GFP-Populationen hochreguliert war (Abb. 4d). Diese ersten neuen Erkenntnisse zur Modulation solcher Stoffwechselwege zeigen bereits deutlich das enorme Potenzial des neuen Ansatzes zur Identifizierung unbekannter stressinduzierter Effekte, die für die rationale Gestaltung von Produktionsstämmen und weitere Anwendungen in der synthetischen Biologie anwendbar sein könnten. Die Erforschung dieser neuartigen Wechselwirkungen kann durch die Anwendung systembiologischer Methoden weiter aufgeklärt werden41. Durch die Nutzung transkriptomischer Datensätze aus verschiedenen Stresszuständen in Kombination mit der RGB-S-Reporteranalyse in weiteren Studien können Forscher die komplexen Zusammenhänge zwischen gemeldeten Stressreaktionen sowie anderen nicht stressbezogenen Signalwegen aufdecken.

Phänotypische Heterogenität ist auch ein besonderes Merkmal bakterieller Biofilme39, die sowohl in der Ökologie als auch im medizinischen und biotechnologischen Bereich von Bedeutung sind42,43. Um lebende E. coli-Biofilme zu untersuchen, verwendeten wir einen mikrofluidischen Durchflusszellenaufbau44, der eine unterbrechungsfreie In-situ-Analyse des RGB-S E. coli durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) ermöglichte (Abb. 5a, b und ergänzende Abb. 12). Die bildgebende Analyse reifer Biofilme, die 96 Stunden lang ohne Stressfaktoren gewachsen waren, ergab typischerweise Signale, die von einigen wenigen, zufällig auftretenden fluoreszierenden Zellen an Stellen in der Mitte des Mikrofluidikkanals stammten (Abb. 5b, „Mitte“). An bestimmten Stellen, beispielsweise am Rand des Fluidkanals, wo das Strömungsprofil zu einer Ansammlung von Biomasse führt, waren jedoch charakteristische Muster fluoreszierender Zellen sichtbar (Abb. 5b, „Rand“). Beispielsweise wurde in aggregierten Zellclustern häufig eine auffällige GFP-Expression beobachtet. Darüber hinaus wurde häufig eine erhöhte RFP-Expression in Zellen nahe der Unterseite des Biofilms beobachtet, was vermutlich auf die Einschränkung der Nährstoffe in den jeweiligen Mikroumgebungen hinweist.

a Schematische Darstellung des Flusskanals, der für die Kultivierung und Echtzeitbildgebung eines lebenden RGB-S-E.-coli-Biofilms verwendet wird, der unter einem kontinuierlichen Fluss von 10 µl/min LB+kan gewachsen ist. Die Positionen „Mitte“ und „Rand“ werden angezeigt. b Ein reifer Biofilm, der 96 Stunden lang gewachsen ist, zeigt hauptsächlich eine geringe heterogene Reaktion, die durch das zufällige Auftreten einzelner gestresster Zellen verursacht wird (obere Reihe). Am Rand des Strömungskanals (untere Reihe) dominieren GFP-exprimierende Zellen die Oberseite des Biofilms, während sich RFP-exprimierende Zellen unten ansammeln. Der Maßstabsbalken beträgt 100 µm für Draufsichten und Unteransichten und 25 µm für Seitenansichten. c Nach 96-stündigem Wachstum des Biofilms kann nur ein basales Hintergrundsignal beobachtet werden, das an zentralen Positionen erkannt wird (kein Stress, I), was auf den normalen Zustand des Biofilms ohne besonderen Stress hinweist. Nach einer weiteren 24-stündigen Behandlung mit Nalidixinsäure (NA, II) zeigten die Zellen im Biofilm ein erhöhtes GFP-Signal (Genotoxizität). Die anschließende Verabreichung von Glyphosat (Gly, III) führt zu einer verringerten GFP-Reaktion bei gleichzeitigem Auftreten einer erhöhten RFP-Reaktion (physiologischer Stress). Eine weitere Behandlung mit Methanol (MeOH, IV) führt zur Induktion starker BFP-Signale (Zytotoxizität). Der Maßstabsbalken beträgt 100 µm. Quantitative rote, grüne und blaue Balken (rechts) stellen den Intensitätsdurchschnitt von RFP, GFP bzw. BFP dar, erfasst aus neun 100-µm2-Regionen. (*) geben die statistische Signifikanz der Antwortmittelwerte (p ≤ 0,05) an, bewertet durch eine einfaktorielle ANOVA für parametrische Gruppen und Kruskal-Wallis-Test für nichtparametrische Gruppen. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) dar. Weitere Bilder verschiedener Mittelpositionen sind in der ergänzenden Abbildung 13 dargestellt. d Interne Organisation der drei Stressreaktionen innerhalb des endgültigen mit MeOH behandelten Biofilms, abgebildet an einer Mittelposition. Der Biofilm zeigt eine blaue Fluoreszenz mit einer zweiten inneren roten Fluoreszenzschicht und einer abschließenden inneren dünnen SOS-Schicht. Die 3D-Maßstabsleiste beträgt 25 µm.

Wichtig ist, dass der Versuchsaufbau die kontrollierte Störung von Biofilmen durch die Verabreichung spezifischer Stressoren unter Verwendung ansonsten unveränderter Umgebungsbedingungen wie konstanter Nährstoffe und Strömung ermöglichte (Abb. 5c und ergänzende Abb. 13). Beispielsweise wurde der reife Biofilm nach einer anfänglichen Wachstumsphase von 96 Stunden ohne Stressor (Abb. 5c, I) nacheinander jeweils 24 Stunden lang Nalidixinsäure (NA), Glyphosat (Gly) und Methanol (MeOH) ausgesetzt Stunden unter unveränderten Strömungsbedingungen. Wie aus den Ergebnissen mit den oben beschriebenen Planktonkulturen zu erwarten war, führte NA zu einem spezifischen Anstieg des GFP-Signals (SOS), was auf eine DNA-Schädigung in biofilmbildenden Zellen hinweist (Abb. 5c, II). Der Austausch der genotoxischen NA gegen den physiologischen Stressor Gly induzierte nicht nur das erwartete hohe RFP-Signal, sondern stellte auch den nicht gestressten GFP-Zustand wieder her (Abb. 5c, III). Der gleiche Effekt wurde auch bei der Anwendung von MeOH als drittem Stressor beobachtet, der eine starke BFP-Reaktion zusammen mit geringfügigen RFP- und GFP-Signalen hervorrief (Abb. 5c, IV), ähnlich der bei Planktonzellen beobachteten multimodalen Reaktion. Diese durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie dokumentierten Biofilmreaktionen korrelieren eindeutig mit den gemessenen quantitativen Reaktionen des Plattenlesegeräts für die jeweiligen Stressfaktoren, die in den Abbildungen dargestellt sind. 2b, c und 3a. Die dynamische Reaktion des lebenden Biofilms konnte auch in Echtzeit überwacht werden (ergänzende Abbildung 14). Diese Ergebnisse dokumentieren anschaulich, dass die molekularen Stressbewältigungsmechanismen von Biofilmen flexibel auf Umweltveränderungen reagieren, was neben anderen Abwehrstrategien auch zur bekannten inhärenten Widerstandsfähigkeit von Biofilmen beitragen sollte.

Störungen durch Stressfaktoren verändern auch die dreidimensionale Organisation im lebenden Biofilm. Beispielsweise zeigte die gesamte Biofilmstruktur nach 24-stündiger MeOH-Gabe erwartungsgemäß eine weitgehend homogene blaue Fluoreszenz (Abb. 5d). Eine detailliertere Analyse mit allen drei Farben ergab jedoch überraschenderweise ein ausgeprägtes dreidimensionales Schichtmuster von Stressreaktionen innerhalb des Biofilms, was auf innere Schichten mit vorherrschender RFP-Fluoreszenz (physiologischer Stress) und eine dünnere GFP-Schicht (SOS) in der Mitte hindeutet. Stressheterogenität und strukturelle Schichtung in Biofilmen wurden mit Mikrogradienten von Nährstoffen, Sauerstoff und Metaboliten in Verbindung gebracht42,45. Die hier beobachtete homogene blaue Fluoreszenz über den gesamten Biofilm mit einer durchschnittlichen Strukturdicke von etwa 50 µm legt nahe, dass die Diffusion von Stressfaktoren unter den verwendeten Bedingungen nicht eingeschränkt war. Daher könnte die Stoffwechselaktivität der Grund für die beobachtete Schichtung sein. Da Sauerstoff durch den Zellstoffwechsel schnell verbraucht wird, könnte die mittlere rote Schicht (Abb. 5d) aus einer lokalen Sauerstofflimitierung resultieren und somit die physiologisch am stärksten beanspruchte und daher SOS-empfindlichste Zone (grün) des Biofilms darstellen. Ähnliche räumliche heterogene Effekte wurden für Pseudomonas aeruginosa-Biofilme beschrieben39, bei denen der Sauerstoffverbrauch durch Oberflächenschichten des Biofilms schneller sein könnte als seine Diffusion in die unteren Schichten, was zusätzlich zu inaktiven dicken Bodenschichten zu einer metabolisch aktiven Oberfläche führt46. Insgesamt zeigen die hier gemachten Beobachtungen zum ersten Mal, dass ein lebender E. coli-Biofilm unter kontinuierlichen Strömungsbedingungen auf zellulärer Ebene mit einer dynamischen und räumlich lokalisierten Reaktion auf Stressoren reagiert. Diese Ergebnisse unterstreichen den Nutzen der hier vorgestellten Technologie und legen nahe, dass eine Kombination mit räumlich-zeitlich aufgelösten Probenahme-39,44 und Sequenzierungstechniken detaillierte Untersuchungen der zugrunde liegenden molekularen und physiologischen Mechanismen in solch komplexen mikrobiellen Gemeinschaften ermöglichen sollte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der hier beschriebene RGB-S-Reporter Multistressanalysen in bakteriellen Plankton- und Biofilmpopulationen ermöglicht und Populationsreaktionen auf Stress sowie Populationsheterogenität und räumliche Organisation aufdeckt. Da sich die fluoreszierenden Proteine aufgrund ihrer Stabilität und Signalschwankungen bei längeren Messungen mit der Zeit ansammeln, kann die Genauigkeit der relativen Quantifizierung in Experimenten, die länger als 5 Stunden dauern, beeinträchtigt werden. Dies könnte in weiteren Studien durch den Einsatz weniger stabiler Reporterproteine behoben werden. Da das vorliegende Biosensorsystem auf einem Multikopie-Plasmid basiert, um eine schnelle Signalverstärkung und Empfindlichkeit bei niedrigen Stressorkonzentrationen zu ermöglichen, können Probleme mit der Plasmidstabilität, insbesondere bei verdünnten Kulturen, zu verzerrten oder stochastischen Tests führen. Eine genomintegrierte Biosensorkassette kann in weiteren Studien untersucht werden, um solche Probleme zu überwinden. Ein weiterer zukünftiger Vorschlag besteht darin, den Sensorstamm mit einem kompatiblen, konstitutiv exprimierten vierten fluoreszierenden Protein zu markieren, was die Visualisierung und Lokalisierung aller Zellen insbesondere im 3D-Raum heterogener Biofilme ermöglicht und so das Verhältnis von gestressten zu nicht gestressten Zellen abschätzt. Da der neuartige Biosensor mit modernen Hochdurchsatz-Screening- und Bildgebungssystemen47 kompatibel ist, wird diese Art von Multistress-Biosensoren die Erfassung umfangreicher Daten ermöglichen, um die schnelle, robuste und umfassende Analyse der bakteriellen Reaktion auf vorübergehende und dauerhafte Umweltveränderungen zu ermöglichen . Wir glauben, dass dieser Ansatz nicht nur für die Grundlagenforschung im Zusammenhang mit der Stressentstehung von Antibiotikaresistenzen48 und der Stressheterogenität innerhalb von Biofilmen42,43 von großem Wert ist, sondern auch für praktische Anwendungen in der Medizin und Biotechnologie.

Der RGB-S-Reporter wurde durch Fusion von drei synthetischen Sensorelementen konstruiert und in das Grundgerüst pMK-RQ [kanR & ColE1 ori] (GeneArt® Gene Synthesis, ThermoFisher Scientific und IDT Inc.) kloniert (ergänzende Abbildung 1). Jedes Sensorkonstrukt besteht aus drei Teilen: a) einem auf Stress reagierenden Promotor, b) einem fluoreszierenden Reporterprotein und c) einem Transkriptionsterminator. Basierend auf den Hauptkriterien einer schnellen und spezifischen Reaktion wurden auf der Grundlage von Literaturstudien auf Stress reagierende Promotoren ausgewählt. Sequenzen der ausgewählten Promotoren wurden aus der Genomsequenz von E. coli str erhalten. K12 Unterstr. MG1655 (GenBank: U00096.3). Fluoreszierende Proteine wurden im Hinblick auf hohe Signalintensität und spektrale Kompatibilität ausgewählt. Um ihre Translationsraten zu erhöhen, wurden Codons für ausgewählte fluoreszierende Proteine mithilfe der GeneOptimizer™-Software (ThermoFisher Scientific)25 für E. coli optimiert. Sequenzen fluoreszierender Proteine sowie Transkriptionsterminatoren wurden aus den gut dokumentierten Teilen des Registry of Standard Biological Parts (parts.igem.org) erhalten. Die Sequenzen aller genetischen Elemente sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Für die Handhabung genetischer Designs in silico wurde die Software Geneious 9.1.8 (Biomatters Ltd.) verwendet. Das Plasmidrückgrat enthielt das Kanamycin-Resistenzgen (kanR), für das Kanamycin zur Selektion in allen Brühen und Agarmedien (LB+kan) in einer Endkonzentration von 50 µg/ml bereitgestellt wurde.

Der RGB-S-Reporter wurde mithilfe der isothermen Klonierungsreaktion49 Gibson Assembly® Master Mix (NEB Inc.) gemäß dem Protokoll des Herstellers zusammengesetzt. Bei Bedarf wurde die Matrizen-DNA durch DpnI-Behandlung entfernt. 1 µl des methylierungsempfindlichen Restriktionsenzyms DpnI und 2 µl CutSmart®-Puffer (beide von NEB Inc.) wurden zu der zusammengesetzten Reaktion gegeben und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Das Reaktionsprodukt wurde zur Transformation des chemisch kompetenten E. coli-Klonierungsstamms DH5α (Laborstamm) verwendet, dann auf LB+kan-Agar (50 µg/ml) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Alle Plasmide wurden mit dem ZR Plasmid Miniprep – Classic (Zymo Research Inc.) gemäß dem Protokoll des Herstellers gereinigt, sequenzverifiziert (LGC-Genomik) und bei –20 °C gelagert.

Die allgemeine Klonierungsstrategie ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Nach der anfänglichen Konstruktion des Zweifarbensensors (RG-S-Reporter genannt), bestehend aus PsulA::GFPmut3b::terminator_1 und PosmY::mRFP1::terminator_2, wurde dieser Vektor linearisiert unter Verwendung der Primer O17051-F und O17052-R und zusammengebaut mit dem dritten Sensorelement (Terminator_3::PgrpE::mTagBFP2::Terminator_4), was zum endgültigen Dreifarben-/Stress-Sensing-Plasmid namens RGB-S-Reporter führte.

Die in dieser Studie verwendeten Chemikalien sind: EtOH 96 % ANALAR, 1-BuOH ANALAR und 2-Propanol HPLC-Qualität von VWR International GmbH. Nalidixinsäure, Ciprofloxacin, Dimethylsulfoxid (DMSO) in Zellkulturqualität, Chloramphenicol in molekularbiologischer Qualität, Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranosid (IPTG), Kanamycinsulfat, Ampicillin-Natriumsalz und Glucose-Monohydrat von PanReac AppliChem. MeOH und Aceton hatten Analysequalität, Phenol hatte Synthesequalität, Acetat 100 % und Glycerin Analysequalität von Merck, Darmstadt, Deutschland. Glyphosat, Roundup® Gran 420 g/kg als Natriumsalz von Monsanto, Deutschland. Natriumdodecylsulfat (SDS)-Elektrophoresequalität von BioRad. Fruktose ≥99 % von Sigma-Aldrich. Furfural 99 % von Acros Organics.

Für Stress-Sensing-Assays wurden chemisch kompetente Zellen von Wildtyp-E. coli K12 MG1655 DSMZ 18039 (DSMZ GmbH, Deutschland) mit dem RGB-S-Reporter (bezeichnet als RGB-S E. coli) transformiert und wie beschrieben auf LB+kan-Agar ausplattiert über. Eine Samenbank aus Glycerin-Kryostock des RGB-S E. coli wurde unter Verwendung einer einzelnen reinen Kolonie hergestellt, um die phänotypische Heterogenität in den Stresstests zu minimieren. Von einer LB+kan-Agarplatte über Nacht wurden mehrere Einzelkolonien in jeweils 5 ml LB+kan-Brühe inokuliert und in einem 180-U/min-Schüttler bei 37 °C inkubiert. Von diesen exponentiell wachsenden Kulturen wurden Kryostock-Aliquots mit 15 % Glycerin bei –80 °C gelagert. Zu Beginn jedes neuen Stresstest-Experiments wurde ein frisches Aliquot verwendet.

Das Testprotokoll wurde entwickelt, um den Stresszustand der Kultur auch bei hohem Stressniveau, bei dem kein weiteres Kulturwachstum stattfand, zuverlässig zu bestimmen. Der Stresstest begann mit der Verwendung eines Aliquots der Samenbank, um zwei unabhängige Kulturen (Kult. 1 und Kult. 2) jeweils in 5 ml LB+kan-Brühe zu beimpfen und über Nacht in einem 180-U/min-Schüttler bei 37 °C zu inkubieren. Am nächsten Tag wurden die Kulturen mit frischem LB+kan auf 1:250 verdünnt und erneut 5–6 Stunden lang unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Nachdem eine ausreichende optische Dichte erreicht war, wurden die Kulturen mit frischem LB+kan verdünnt, um die OD600 auf 0,4 einzustellen, was dem Zweifachen der endgültigen Zelldichte in der Testplatte entspricht. Gleichzeitig wurden die chemischen Stressmittel in LB+kan auf das Zweifache der endgültigen erforderlichen Konzentration verdünnt. Die Stressbehandlung begann mit der Zugabe von 250 µl verdünnter RGB-S-E.-coli-Kultur zu 250 µl LB-Stressgemisch (oder LB ohne Stressor als Kontrollkultur), um ein Gesamtvolumen von 500 µl zu erhalten, das eine endgültige Zelldichte von OD600 0,2 aufwies und 1X Stressorkonzentration. Nach dem Mischen wurde jede der beiden Kulturen (Kult. 1 und Kult. 2) dann in drei Replikaten in einer 96-Mikrowell-Platte verteilt, wobei jede Vertiefung 150 µl enthielt. Insgesamt wurden sechs unabhängige biologische Replikate für jede Stresskonzentration analysiert, sofern nicht anders angegeben. Die Mikrotiterplatte wurde dann mit einer fluoreszenzkompatiblen transparenten Folie (Lab Logistics Group Inc.) abgedeckt, um die Verdunstung der Kultur zu verhindern, und in einem Synergy H1-Mikroplattenlesegerät (BioTek Inc.) unter kontinuierlichem Orbitalschütteln (282 cpm, 3 mm) bei 37 °C inkubiert °C und Messung der optischen Dichte (OD600) und der drei Fluoreszenzanzeigen bei den in der Ergänzungstabelle 1 angegebenen Wellenlängen in zugewiesenen Zeitintervallen.

Zur UV-Bestrahlung wurde eine keimtötende UV-C-Lampe (Philips UV-C, TUV30W G30T8) verwendet. Die Lampe wurde vor der Bestrahlung 30 Minuten lang eingeschaltet, um die maximale Leistungsintensität zu erreichen. Zwei Kulturen wurden wie oben angegeben hergestellt und mit frischem LB+kan auf OD600 0,2 verdünnt. 1 ml jeder verdünnten Kultur wurde in eine sterile 60-mm-Petrischale gegossen, um eine große Fläche einer homogenen dünnen Kulturschicht zu bilden, und in Duplikaten für verschiedene Zeiträume UV-Licht ausgesetzt. Die bestrahlten Kulturen wurden dann sofort in dreifacher Ausfertigung auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verteilt und wie zuvor beschrieben inkubiert. Kontrollkulturen wurden nach dem gleichen Verfahren behandelt, jedoch ohne UV-Exposition.

Für die 2D-mikroskopische Bildgebung wurde ein ApoTome-Invertierungsfluoreszenzmikroskop (Carl Zeiss Inc.) verwendet. 10 µl einer mit Stressor behandelten Kultur wurden auf einen Objektträger aus Glas geladen und mit einem Glasschlupf abgedeckt. Anschließend wurden die Bilder mit den kompatiblen drei Lichtfiltersätzen entsprechend den drei fluoreszierenden Proteinen abgebildet (Satz 43 HE für RFP, Satz 44 für GFP und Satz 49). für BFP), wie in der Ergänzungstabelle 1 angegeben. Vor der Bildgebung der mit Stress behandelten Kulturen wurden die Bildaufnahmeeinstellungen unter Verwendung einer nicht gestressten Kontrollkultur auf den Leerwert eingestellt. Die drei Fluoreszenzkanäle wurden für dasselbe Feld mit der AxioVision-Software (Carl Zeiss Inc.) abgebildet und ihre Fluoreszenzintensität wurde in einer Nachschlagetabelle (LUT) als linearer Gradient angezeigt, der von ImageJ50 (imagej.nih.gov/ij) erstellt wurde.

Die Plasmidstabilität wurde unter Verwendung des gleichen oben beschriebenen Stresstestprotokolls getestet, mit Ausnahme des Kulturvolumens, das auf 5 ml LB-Kulturen in Kulturröhrchen geändert wurde. Um das Vorhandensein von Plasmiden in den Zellen anzuzeigen, wurden alle Kulturen mit 6 µg/ml Nalidixinsäure als Auslöser der durch das GFP-Signal angezeigten Genotoxizität gestresst. Zusätzlich wurde das Vorhandensein von Plasmiden durch Ausplattieren auf Kanamycin-selektiven Agarplatten bestätigt. Für die in der ergänzenden Abbildung 5a, b gezeigten Alterungskulturen wurden drei unabhängige LB-Kulturen, ergänzt mit der Standard-Kanamycin-Konzentration (50 µg/ml, +Kan), und drei weitere Kulturen ohne Kanamycin (-Kan) bei 180 U/min unter Schütteln bei 37° inkubiert C für drei Tage. Zu Beginn des Experiments sowie in 24-Stunden-Intervallen wurden die OD600- und GFP-Fluoreszenzwerte gemessen, um das Vorhandensein von Plasmiden zu überprüfen. Für die in den ergänzenden Abbildungen 5c, d gezeigten Verdünnungskulturen wurden identische Verfahren angewendet, mit der Ausnahme, dass die Kulturen täglich verdünnt wurden, indem 20 µl übertragen wurden, um eine frische 5 ml LB-Brühe mit (+Kan) und ohne (-Kan) zu beimpfen. Kanamycin. Die Messungen der optischen Dichte und der Fluoreszenz wurden am Ende jedes Intervalls vor dem Kulturtransfer dokumentiert. Am vierten Tag der Subkultivierung wurden +Kan- und -Kan-Kulturen verdünnt und auf LB+kan-Agarplatten ausplattiert, 24 Stunden bei 37 ° C inkubiert, dann wurden die Kolonien gezählt und in der ergänzenden Abbildung 5e aufgetragen.

Der Stamm RGB-S E. coli wurde 5 Stunden lang bei 37 °C in zwei Kulturen von jeweils 500 ml mit 2-Propanol 2 % (Vol./Vol.) behandelt, wobei das oben beschriebene Standard-Stresstestprotokoll verwendet wurde. Unbehandelte Kulturen wurden unter den gleichen Bedingungen wie die Kontrolle hergestellt. Kontrollzellen wurden dann mit 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine ungefähre Konzentration von 1 × 106 Zellen ml–1 verdünnt und im Zellsortierer analysiert, um den Schwellenwert für das Hintergrundfluoreszenzsignal für die Sortierung der behandelten Proben festzulegen. Anschließend wurden Populationen von mit RGB-S E. coli behandelten Zellen ebenfalls mit PBS verdünnt und mithilfe eines MoFlo Die Analyse nach der Akquisition wurde mit der FlowJo-Software (BD Biosciences) durchgeführt. Sowohl nicht gestresste Kontrollproben als auch Subpopulationen von gestresstem Mono-RFP, Mono-GFP, Dual-RFP-GFP, Dreifach-RFP-GFP-BFP mit Stressfluoreszenzsignalen über dem Kontrollhintergrundschwellenwert wurden in Duplikaten sortiert. Das Gating der oben genannten Populationen ist in der ergänzenden Abbildung 10 dargestellt. Für jede Probe wurden eine Million Zellen (mit Ausnahme von RFP-2 und RFP-GFP-2, die 0,7 bzw. 0,75 Millionen Zellen erhielten) in 250 µl RNAPure™ peqGOLD sortiert (VWR International GmbH) gelöst, dann sofort gevortext und bis zur Extraktion auf Eis gehalten.

Die RNA wurde mit dem Direct-zol RNA Miniprep Kit (Zymo Research Inc.) gemäß dem Standardprotokoll extrahiert. Nach der Extraktion wurde eine DNase-Behandlung mit dem TURBO DNA-free™ Kit (Invitrogen) durchgeführt und die RNA in 1 µl RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Promega Corporation) gelagert. Die RNA wurde mit dem Qubit™ RNA HS Assay Kit (Invitrogen) quantifiziert. Sofort wurden RNA-Bibliotheken mit dem Zymo-Seq RiboFree® Total RNA Library Kit (Zymo Research Inc.) mit einigen Modifikationen erstellt. Dazu gehörte die Verlängerung der Erststrang-cDNA-Synthese-Inkubation bei 48 °C auf 1,5 Stunden, die Beibehaltung des RiboFree®-Depletionsschritts auf 2 Stunden, selbst wenn die RNA-Konzentrationen <250 ng waren, unter Verwendung von RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research Inc.). die erste Reinigung nach dem RiboFree®-Depletionsschritt (gemäß Anhang E) und die zweite Wiederholung des letzten Bead-Reinigungsschritts nach der PCR, um Adapterdimere zu entfernen. Die Konzentration und Größe der Bibliothek wurde mit dem Qubit™ dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen) und dem Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies Inc.) quantifiziert. RNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung eines Illumina NextSeq 550 mit dem High Output Kit v2.5 -150 Cycles (2 × 75 bp Paired-End) (Illumina Inc.) sequenziert.

Alle RNA-Extraktionen und Bibliotheksvorbereitungen wurden unter einer Laminar-Flow-PCR-Werkbank (STARLAB International GmbH) durchgeführt, die entweder mit RNase AWAY® oder DNase AWAY® (Molecular Bio-Products Inc.) und UV dekontaminiert wurde.

Die Sequenzablesungen wurden mit FastQC v0.11.9 (www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc) qualitätsgeprüft und mit Trim Galore51 qualitätsgetrimmt. Die rRNA-Lesevorgänge wurden mit SortMeRNA v4.3.4 (Datenbanken silva-bac-16s-id90 und silva-bac-23s-id98 als Referenz) mit Standardeinstellungen entfernt52. Die gefilterten Lesevorgänge wurden mit dem STAR-Aligner v2.7.6a53 dem Genom von E. coli MG1655 (ASM584v2) zugeordnet, das so bearbeitet wurde, dass es die Sensorkonstruktsequenzen enthielt. Die Intron-Ausrichtung wurde durch Festlegen von --alignIntronMax 1 deaktiviert und Lesepaare wurden beibehalten, wenn der längennormalisierte Alignment-Score und die längennormalisierte Anzahl übereinstimmender Basen mindestens 0,5 betrugen. Die Lesezahlen für jedes Gen wurden mithilfe von featureCounts54 bestimmt. Die Zählungen wurden normalisiert und differenziell transkribierte Gene wurden mit DESeq2 in R v3.6.355,56 analysiert (padj = < 0,05). Das Design für DESeq2 war darauf ausgelegt, die Variation zwischen den vier verschiedenen RGB-S-E.-coli-Subpopulationen zu testen. Als statistischer Test wurde der Likelihood Ratio Test (LRT) verwendet. Die Kontrollproben wurden zur Berechnung der log2-fachen Änderungen zwischen allen Proben verwendet, jedoch nicht zur Bestimmung signifikanter Gene zwischen den vier Subpopulationen. Signifikant transkribierte Gene wurden dann als Input für die Gene Set Variation Analysis (GSVA) verwendet, um angereicherte Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Pfade zu bestimmen40,57. Hier wurde die Anzahl der mindestens erforderlichen Gene auf 5 festgelegt.

Für die 3D-Biofilmbildgebung wurde der RGB-S-E.-coli-Stamm in einem Mikrofluidikchip mit geraden Durchflusszellen gezüchtet. Die gasdurchlässige Mikrofluidikstruktur bestand aus elastomerem Polydimethylsiloxan (PDMS) (Sylgard 184, Down Corning) und war mit einem Cyclo-Olefin-Polymer-Film (COP) (HJ-Bioanalytik GmbH, Deutschland) verbunden (ergänzende Abbildung 12). Der Biofilm wurde im Chip auf dem Tisch eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (CLSM) (ZEISS LSM 880, Carl Zeiss Inc.) bei einer konstanten Temperatur von 37 °C und einem kontinuierlichen LB+kan-Fluss von 10 µl/min gezüchtet unter Verwendung einer Nexus 3000 Spritzenpumpe (Chemyx Inc.). Der anfängliche reife Biofilm wurde 96 Stunden lang gezüchtet. Nach der Reifung des Biofilms wurden die Bildaufnahmeeinstellungen angepasst, um jede basale Stressreaktion entsprechend dem Kontrollbiofilm vor der Anwendung der Stressfaktoren zu visualisieren. Nach dieser Grundeinstellung blieben die Aufnahmeparameter während des gesamten Experiments identisch. LB+kan mit SOS-Induktor Nalidixinsäure 6 µg/ml wurde 24 Stunden lang mit der gleichen Flussrate durch den Chip gepumpt, gefolgt von LB+kan + Glyphosat 2 % (Gew./Vol.) 24 Stunden lang und zuletzt gefolgt von Methanol 8 % (v/v) für 24 h. Die Bilder wurden mit der Software ZEN 2.0 black (Carl Zeiss Inc.) mit den in der Ergänzungstabelle 1 gezeigten Fluoreszenzaufnahmespektren aufgenommen. 3D-Biofilmbilder wurden mit der Software ZEN 2.3 Blue Edition (Carl Zeiss Inc.) erstellt.

Um die in Abb. 5c und der ergänzenden Abb. 13 gezeigten Fluoreszenzintensitätsbalken zu erzeugen, wurde mit ZEN 2.3 Blue Edition ein orthogonales xy-2D-Bild erstellt, das die Z-Stapelschichten summiert, für insgesamt 9 Sichtfeldpositionen. Jedes Sichtfeld war ein Quadrat von 100 µm2. Diese Regionen wurden verwendet, um die integrierte Fluoreszenzintensität (IntDen) für die drei Kanäle mithilfe von ImageJ zu berechnen.

Für die Datenanalyse wurde Microsoft Excel verwendet. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurde IBM SPSS Statistics v.24.0 (IBM Inc.) verwendet. Für Abb. In den Abbildungen 2b, 3a, 5c und der ergänzenden Abbildung 13 wurden Kolmogorov-Smirnov- und Levene-Tests zur Bestimmung der Normalität bzw. Homogenität verwendet. Für Abb. 5c und die ergänzende Abb. 13 wurden parametrische 3-Farben-Gruppen durch eine einfache ANOVA gefolgt von LSD als Post-hoc-Analyse verglichen, während nichtparametrische Gruppen durch den Kruskal-Wallis-Test analysiert wurden. Für Abb. 2b und 3a (mit Ausnahme des Hungerexperimentes) wurde die Signifikanz unabhängiger normaler Mittelwerte durch den Independent Samples T-Test und nicht normaler Mittelwerte durch den Mann-Whitney U-Test bestimmt. Für das Hungerexperiment in Abb. 3a wurde die Signifikanz der abhängigen Normalmittelwerte durch den Paired Sample T-Test und der Nichtnormalmittelwerte durch den Wilcoxon Signed Ranks Test bestimmt. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Tests mit einer Konfidenz von 95 % (p ≤ 0,05) unter Verwendung von sechs Wiederholungen durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle in dieser Studie verwendeten oder generierten genetischen Informationen wurden in der Ergänzungstabelle 2 zur Verfügung gestellt. RNA-seq-Daten wurden unter der Zugangsnummer GSE211360 an den Gene Expression Omnibus (GEO) des National Center for Biotechnology Information (NCBI) übermittelt. Die Materialien und Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde durch das Helmholtz-Programm „Materialsystemtechnik“ unter dem Thema „Adaptive und bioinstruktive Materialsysteme“ gefördert. AEZ dankt dem Deutschen Akademischen Austauschdienst (DAAD) und dem ägyptischen Ministerium für Hochschulbildung (MOHE) für die Finanzierung seines Promotionsstipendiums. Wir danken Tim Scharnweber, Minja Celikic und Yong Hu für ihre Hilfe bei der CLSM-Bildgebung.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Institut für Biologische Grenzflächen 1 (IBG-1), Karlsruher Institut für Technologie (KIT), Eggenstein-Leopoldshafen, Deutschland

Ahmed E. Zoheir, Laura Meisch, Christof M. Niemeyer und Kersten S. Rabe

Abteilung für Genetik und Zytologie, Nationales Forschungszentrum (NRC), Kairo, Ägypten

Ahmed E. Zoheir

Institut für Biologische Grenzflächen 5 (IBG-5), Karlsruher Institut für Technologie (KIT), Eggenstein-Leopoldshafen, Deutschland

Morgan S. Sobol & Anne-Kristin Kaster

Europäisches Labor für Molekularbiologie (EMBL), Flow Cytometry Core Facility, Heidelberg, Deutschland

Diana Ordoñez-Rueda

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AEZ, CMN und KSR konzipierten die Forschung. AEZ führte alle Gentechnik-, Stresstest- und Biofilmexperimente durch und analysierte alle entsprechenden Daten. DOR und AEZ führten die FACS-Analyse durch. MSS führte die transkriptomische Analyse durch. LM führte Experimente zur Plasmidstabilität durch und analysierte deren Daten. AEZ, MSS, DO, AKK, CMN und KSR haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Kersten S. Rabe.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zoheir, AE, Sobol, MS, Meisch, L. et al. Ein dreifarbiger Stress-Biosensor zeigt multimodale Reaktionen in einzelnen Zellen und die räumlich-zeitliche Dynamik von Biofilmen. npj Biofilms Microbiomes 9, 57 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00424-1

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Eingegangen: 14. Januar 2023

Angenommen: 31. Juli 2023

Veröffentlicht: 21. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00424-1

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